白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)元缺氧缺血損傷保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：缺氧缺血性腦病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是新生兒致死、致殘的常見病之一。其重要的病理生理改變是遲發(fā)性凋亡。然而迄今為止，缺氧缺血后神經(jīng)元凋亡的確切機(jī)制尚不明確。白藜蘆醇（Resveratrol,RVT）對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病有顯著的保護(hù)作用，但是其對(duì)缺氧缺血性腦損傷的作用機(jī)制尚不明了。本研究旨在探討缺氧缺血條件下腦損傷的發(fā)病機(jī)制、RVT對(duì)新生大鼠皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用及P53相關(guān)機(jī)制

2、，為臨床應(yīng)用新藥治療缺氧缺血性腦損傷提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：(1)新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)和氧糖剝奪再灌注(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)細(xì)胞模型的建立：新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元取自生后24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠。按本實(shí)驗(yàn)室建立的方法培養(yǎng)，待新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至第6天，隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、OGD/R組及RVT組。OGD/R組和RVT組換為無糖DMEM，然后

3、放入37℃，95％N2和5％ CO2高純混合氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組換為高糖DMEM，然后置于37℃，21％O2和5％CO2的普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)40min后，各組細(xì)胞培養(yǎng)基均換成含Neuronbal-A的神經(jīng)元培養(yǎng)液，同時(shí)RVT組給予不同終濃度的RVT（0μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM），重新置于普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后在再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)（0h、1h、2h、4h、8h、12h）收獲細(xì)胞。（2）待新生大鼠大

4、腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至第6天，收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞用MTT法[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay]檢測神經(jīng)元活力；LDH法（Lactate dehydrogenase efflux assay）檢測神經(jīng)元損傷程度；Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞cleaved Caspase-3凋亡蛋白和p-P53蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)缺

5、氧缺血40min后再灌注4h，細(xì)胞凋亡近50％，提示成功建立OGD/R細(xì)胞模型。(2)在再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，OGD/R組MTT值逐漸降低，LDH水平逐漸升高，cleaved Caspase-3表達(dá)水平逐漸升高并且于8h達(dá)峰值，提示皮層神經(jīng)元凋亡是缺氧缺血性腦損傷重要的病理生理改變。(3)再灌注后4h的皮層神經(jīng)元細(xì)胞隨著加入RVT濃度的增加，MTT值逐漸增加，而LDH值逐漸降低，100μM RVT保護(hù)作用最佳，并且在再灌注后8h RVT

6、使cleaved Caspase-3表達(dá)水平明顯降低，提示RVT能夠減少缺氧缺血再灌注后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。(4)在再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)p-P53表達(dá)水平逐漸升高，于4h達(dá)峰值，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加，提示缺氧缺血再灌注后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡可能與P53磷酸化激活相關(guān)。（5）在再灌注后4h，RVT使p-P53表達(dá)水平明顯降低，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減少，提示RVT對(duì)缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用可能通過抑制P53的活化實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：皮層神經(jīng)元凋亡