體外缺血再灌注損傷中神經(jīng)元凋亡發(fā)生機(jī)制及白藜蘆醇苷保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的： 在新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元分離、純化、培養(yǎng)和鑒定的基礎(chǔ)上，建立體外大腦皮層神經(jīng)元缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷模型，闡明體外I/R損傷中神經(jīng)元凋亡發(fā)生機(jī)制，探討白藜蘆醇苷(polydatin，PD)對體外I/R神經(jīng)元損傷的作用。 方法： 在無菌條件下，將出生24h內(nèi)的新生Sprague Dawley大鼠斷頭取腦，剔除腦膜及血管，分離皮層神經(jīng)元，原代培養(yǎng)7d，進(jìn)行純度測定后

2、，再隨機(jī)分為3組：對照組、I/R損傷組和PD治療組。對照組用DMEM/F12培養(yǎng)基處理15min后，用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；I/R損傷組用連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)溶液處理15min后，用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；PD治療組在Na2S2O4溶液處理前、中、后均加入PD進(jìn)行干預(yù)；在繼續(xù)培養(yǎng)0h、6h、12h、24h、48h五個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)獲取標(biāo)本待檢。用AO/EB及DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化，用TUNEL檢測神經(jīng)元凋

3、亡率，免疫組化檢測神經(jīng)元Bcl-2、Bax及NF-KBp65的表達(dá)。 結(jié)果： (1)在倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)7d的大鼠大腦皮層神經(jīng)元胞體飽滿，立體感強(qiáng)，突起較長，相互連接，形成致密的網(wǎng)絡(luò)。 (2)AO/EB及DAPI染色可見I/R損傷組有凋亡細(xì)胞的特征性形態(tài)變化。 (3)I/R損傷組神經(jīng)元凋亡率在0h時(shí)無變化，6h增高，24h達(dá)峰值，48h降低；并在6h、12h、24h及48h對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均高于對照

4、組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。PD治療組神經(jīng)元凋亡率在6h、12h、24h及48h對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均低于I/R損傷組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。 (4)I/R損傷組NF-KBp65的表達(dá)量隨再灌注時(shí)間的延長而增加，24h達(dá)高峰，24h～48h從胞漿向胞核移位明顯，NF-KBp65與Bcl-2/Bax間存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)。PD治療組NF-KBp65表達(dá)量降低，在6h、12h、24h及48h對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)低于I/R損傷

5、組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。I/R損傷組Bax的表達(dá)量隨再灌注時(shí)間的延長而明顯增加，24h達(dá)高峰，之后降低；Bcl-2的表達(dá)量及Bcl-2/Bax比率均在6h達(dá)高峰，隨后漸降低；且Bcl-2/Bax比率與凋亡間存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)。PD治療組Bcl-2增高而Bax降低，與I/R損傷組在6h、12h、24h及48h對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的值相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。 結(jié)論： (1)在分離、純化、培養(yǎng)和鑒定新