白藜蘆醇及鋅對(duì)心肌缺血-再灌注損傷的線粒體保護(hù)機(jī)制.pdf

1、第一部分白藜蘆醇的心肌保護(hù)作用及其機(jī)制的研究
　　缺血性心肌損傷是當(dāng)今人類疾病導(dǎo)致死亡的主要原因之一。冠狀動(dòng)脈血流中斷和再灌注致心肌壞死和心肌收縮功能喪失，稱為心肌缺血/再灌注損傷。再灌注對(duì)心肌產(chǎn)生一系列影響，包括心肌超微結(jié)構(gòu)的變化以及心肌能量代謝的變化。目前，缺血/再灌注損傷發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞粘附因子與細(xì)胞凋亡等均參與缺血/再灌注損傷。其中，自由

2、基和鈣超載互為因果，在缺血/再灌注損傷中具有重要意義。近年來(lái)對(duì)心肌缺血再灌注損傷的研究取得了很大進(jìn)展，很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明許多藥物能夠減輕心肌缺血再灌注損傷。其中白藜蘆醇（Resveratrol，化學(xué)名為3,4,5-三羥基二苯乙烯）的心肌保護(hù)作用受到廣泛關(guān)注。這是因?yàn)榘邹继J醇長(zhǎng)久以來(lái)被認(rèn)為是“法國(guó)悖論”的關(guān)鍵因素，即有喝紅酒習(xí)慣的法國(guó)人雖然吃了很多高熱量的飲食，但心血管疾病發(fā)病率卻很低。白藜蘆醇是一種在紅酒和葡萄中存在的多酚類化學(xué)物質(zhì)，具有

3、強(qiáng)大的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎癥等生物學(xué)特性。目前研究認(rèn)為，白藜蘆醇通過(guò)誘導(dǎo)藥物性預(yù)處理機(jī)制減輕缺血/再灌注損傷，但其詳細(xì)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子機(jī)制尚不清楚。最近研究表明，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)移孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）在心肌缺血/再灌注損傷中起關(guān)鍵性作用。缺血時(shí)，mPTP保持關(guān)閉狀態(tài)，而再灌注時(shí)mPTP開(kāi)放。而且研究發(fā)現(xiàn)，mPTP開(kāi)放發(fā)生在再灌注早期而不是在缺血期

4、。因此，在早期再灌注時(shí)如能有效地抑制mPTP的開(kāi)放，是保護(hù)再灌注心肌的關(guān)鍵。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的作用最初認(rèn)為是調(diào)節(jié)糖原合成，并參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖與分化、凋亡等過(guò)程。最近研究證實(shí)，GSK-3β在心肌保護(hù)中也起非常重要的作用，其機(jī)制主要是通過(guò)其Ser9位點(diǎn)的磷酸化，使其活性被抑制，進(jìn)一步阻止mPTP的開(kāi)放而保護(hù)再灌注損傷的心肌。鑒于以上研究，白藜蘆醇

5、在心肌缺血/再灌注損傷中的保護(hù)作用可能是通過(guò)GSK-3β的失活并抑制mPTP的開(kāi)放而引起。因此，本研究對(duì)GSK-3β和mPTP在白藜蘆醇誘導(dǎo)的心肌保護(hù)中的作用進(jìn)行了初步探討。
　　本實(shí)驗(yàn)首先制備大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型（Langendorff裝置），用TTC染色法測(cè)定心肌梗塞面積。結(jié)果顯示，離體大鼠心臟再灌注時(shí)給予白藜蘆醇（10μmol/L），可以明顯減少心肌梗塞面積，明顯增加再灌注時(shí)冠狀動(dòng)脈流量（coronary flow

6、，CF）和左心室發(fā)展壓（left ventricular-developed pressure，LVDP）。白藜蘆醇的這種抗梗塞作用可被mPTP開(kāi)放激動(dòng)劑蒼術(shù)苷（atractyloside）所逆轉(zhuǎn)，提示白藜蘆醇通過(guò)抑制mPTP的開(kāi)放而保護(hù)再灌注心臟。另外，線粒體腫脹試驗(yàn)顯示，白藜蘆醇能夠抑制Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹，再次證明白藜蘆醇能夠抑制心肌細(xì)胞mPTP的開(kāi)放。
　　其次，用Western blotting的方法檢測(cè)離體大鼠心臟

7、GSK-3β的磷酸化（Ser9位點(diǎn)）。結(jié)果顯示，白藜蘆醇明顯增加再灌注時(shí) GSK-3β的磷酸化（Ser9位點(diǎn)），說(shuō)明白藜蘆醇能夠使GSK-3β失活。白藜蘆醇抑制GSK-3β活性的作用被鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑 ODQ所阻斷，并且白藜蘆醇使再灌注心臟血管擴(kuò)張刺激磷蛋白（vasodilator-stimulated phosphoporotein，VASP）的磷酸化增加，說(shuō)明白藜蘆醇誘導(dǎo)的GSK-3β磷酸化作用與鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-蛋白激酶

8、G（GC-cGMP-PKG）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。由于GSK-3β失活可以抑制mPTP的開(kāi)放，從而保護(hù)再灌注心肌，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了線粒體GSK-3β的水平。結(jié)果顯示，再灌注時(shí)給予白藜蘆醇明顯增加線粒體GSK-3β水平。由于在生理?xiàng)l件下GSK-3β主要存在于細(xì)胞漿，因此白藜蘆醇使GSK-3β從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體，從而使GSK-3β有機(jī)會(huì)與mPTP結(jié)合。在分離的大鼠心肌細(xì)胞中，白藜蘆醇使線粒體GSK-3β增加的作用同樣被鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑

9、ODQ所阻斷，進(jìn)一步證實(shí)cGMP-PKG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)白藜蘆醇誘導(dǎo)的GSK-3β由胞漿向線粒體的轉(zhuǎn)移。
　　另外，利用免疫共沉淀方法探討轉(zhuǎn)移到線粒體的GSK-3β與mPTP成分相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，GSK-3β與mPTP的組成成分親和素D（Cyclophilin D，CypD）相結(jié)合，而不和外膜上的電壓依賴性陰離子通道（the Voltage-Dependent Anion Channel，VDAC）或內(nèi)膜上的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶（th

10、e Adenine-Nucleotide Translocase，ANT）相互作用，表明白藜蘆醇通過(guò)誘導(dǎo)GSK-3β與線粒體膜成分親和素D結(jié)合而抑制mPTP開(kāi)放，從而保護(hù)心臟。
　　小結(jié)
　　1.白藜蘆醇通過(guò)使GSK-3β失活而抑制mPTP開(kāi)放，保護(hù)再灌注心肌。
　　2.白藜蘆醇通過(guò)cGMP-PKG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使GSK-3β失活并誘導(dǎo)其從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體。
　　3.轉(zhuǎn)移至線粒體的GSK-3β最終與線粒體膜成分親

11、和素D結(jié)合而抑制mPTP開(kāi)放，從而保護(hù)心臟。
　　第二部分鋅的心肌保護(hù)作用及其機(jī)制的研究
　　鋅存在于所有細(xì)胞中，除了構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、酶、及轉(zhuǎn)錄因子外，其本身參與多種生理功能。它通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)識(shí)別、第二信使代謝、蛋白激酶的磷酸化等在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。最近研究報(bào)道，鋅能夠激活PI3K/Akt信號(hào)途徑，抑制GSK-3β活性，而PI3K/Akt及GSK-3β在心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)中起重要作用。GSK-3β失活而阻

12、止 mPTP開(kāi)放，是許多藥物性預(yù)處理保護(hù)心臟的共同機(jī)制。因此，本實(shí)驗(yàn)利用H9C2大鼠心肌細(xì)胞株，探討外源性鋅能否通過(guò)抑制GSK-3β活性而阻止mPTP的開(kāi)放，從而保護(hù)缺血再灌注心肌細(xì)胞。
　　本實(shí)驗(yàn)首先用ZnCl2（10μmol/L）及鋅載體Pyrithion處理H9C2細(xì)胞20分鐘，然后利用 Western blotting的方法分析 GSK-3β磷酸化情況。結(jié)果顯示，鋅能使GSK-3β（Ser9）磷酸化明顯增加，提示外源性鋅可

13、抑制H9C2細(xì)胞中GSK-3β的活性。
　　其次，為了分析鋅抑制GSK-3β的信號(hào)介導(dǎo)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)用PI3K、mTOR以及PKC抑制劑LY-294002、Rapamycin及Chelerythrine處理了細(xì)胞。結(jié)果顯示，鋅誘導(dǎo)的GSK-3β磷酸化增加的作用被LY-294002而不是Rapamycin及Chelerythrine所抑制，鋅能夠明顯增加 Akt而不是 mTOR的磷酸化水平，提示 PI3K/Akt而不是mTOR或PKC

14、參與鋅的作用。
　　進(jìn)一步的研究顯示，鋅能夠明顯增加線粒體GSK-3β磷酸化水平，表明線粒體參與鋅的作用。鋅誘導(dǎo)的線粒體GSK-3β磷酸化增強(qiáng)的作用沒(méi)有被線粒體ATP敏感性鉀離子通道（mKATP）抑制劑5-HD所阻斷，表明 mKATP不參與鋅誘導(dǎo)的線粒體GSK-3β磷酸化過(guò)程。在H9C2細(xì)胞缺血/再灌注模型中，鋅能夠明顯減輕再灌注時(shí)細(xì)胞死亡，表明鋅能防止再灌注損傷。為了進(jìn)一步探討GSK-3β是否在其中發(fā)揮作用，利用持續(xù)激活型GSK

15、-3β質(zhì)粒DNA（GSK-3β-S9A-HA，不受GSK-3β上游激酶下調(diào)而持續(xù)激活）轉(zhuǎn)染了細(xì)胞。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了這種質(zhì)粒的細(xì)胞中，鋅不能減輕再灌注損傷。用持續(xù)抑制型 GSK-3β（GSK-3β-KM-HA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞死亡率也明顯降低，提示GSK-3β失活在鋅引起的心肌保護(hù)中起重要作用。
　　另外，共聚焦顯微鏡觀察顯示，鋅明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的TMRE熒光減少，而在 GSK-3β-S9A-HA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中鋅的這種作用消失，表