番茄紅素保護(hù)線粒體DNA減輕心肌缺血-再灌注損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　心血管疾病是人類健康的第一殺手，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展和人口老齡化，我國(guó)心血管疾病的患病率持續(xù)增加，心肌梗死的發(fā)生率也日益升高。心肌梗死常常危及生命，盡早有效地恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng)，是阻止缺血性心肌損傷的發(fā)展、減小梗死面積進(jìn)而改善臨床預(yù)后的根本措施。然而，缺血心肌恢復(fù)血液灌注后產(chǎn)生的再灌注損傷往往難以避免。除此之外，再灌注損傷也常常存在于器官移植、體外循環(huán)、休克復(fù)蘇等情況中。
　　近年來(lái)，盡管在缺血/再灌注損傷的防治

2、和機(jī)制研究中已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但如何有效的預(yù)防和減輕缺血/再灌注損傷仍然是臨床工作者們面臨的重要難題。有研究表明氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙在缺血/再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用。線粒體DNA易受到氧化應(yīng)激損傷。但缺血/再灌注損傷與線粒體DNA之間的關(guān)系尚不明確。
　　番茄紅素是一種脂溶性的抗氧化劑，屬于類胡蘿卜素中的一種，富含于番茄及其它各種紅色蔬菜和水果之中，常溫下呈紅褐色長(zhǎng)針狀晶體。最近有研究表明番茄紅素可以保護(hù)線粒體DNA使其

3、免于氧化損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠減輕缺氧/復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞凋亡。
　　目的：本研究旨在探討線粒體DNA損傷在心肌缺血/再灌注損傷中的作用及其可能的機(jī)制，以及番茄紅素能否通過(guò)保護(hù)線粒體DNA減輕心肌缺血/再灌注損傷，同時(shí)我們對(duì)番茄紅素保護(hù)線粒體DNA的機(jī)制也進(jìn)行了探討。
　　方法:
　　1.大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型:結(jié)扎心臟冠狀動(dòng)脈左前降支，30 min后打開結(jié)扎部位讓心肌重新獲得血液灌注并持續(xù)24 h。H9

4、c2細(xì)胞缺血/再灌注損傷的體外模型:將H9c2細(xì)胞缺氧6h，復(fù)氧12h。為了驗(yàn)證缺血/再灌注能夠引起線粒體DNA的損傷，通過(guò)免疫熒光的方法來(lái)檢測(cè)心肌組織及H9c2細(xì)胞中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)，并通過(guò)COXⅣ抗體來(lái)識(shí)別心肌組織中的線粒體，通過(guò)線粒體的紅色熒光探針Mitotracker Red來(lái)標(biāo)定H9c2細(xì)胞中的線粒體，觀察8-OHdG是否與線粒體重合。同時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)心肌組織及H9c2細(xì)胞中線粒體DNA拷貝數(shù)

5、及線粒體DNA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　2.為了明確在上述缺血/再灌注動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中是否存在線粒體功能障礙，通過(guò)試劑盒對(duì)心肌組織及H9c2細(xì)胞中的ATP進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，還通過(guò)熒光探針JC-1對(duì)H9c2細(xì)胞線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.為了明確線粒體DNA損傷本身是否能夠?qū)е戮€粒體功能障礙，用低濃度的溴化乙錠處理H9c2細(xì)胞來(lái)耗竭細(xì)胞中的線粒體DNA，然后對(duì)H9c2細(xì)胞的線粒體膜電位，細(xì)胞中的ATP水平以及細(xì)胞存活率進(jìn)

6、行檢測(cè)。同時(shí)，對(duì)H9c2細(xì)胞中線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體DNA基因轉(zhuǎn)錄水平也進(jìn)行了檢測(cè)。
　　4.為了明確番茄紅素是否能夠通過(guò)保護(hù)線粒體DNA來(lái)減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷。通過(guò)2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色的方法來(lái)測(cè)定大鼠心肌缺血/再灌注后心臟的梗死面積。收集大鼠血漿，檢測(cè)肌鈣蛋白、乳酸脫氫酶以及肌酸激酶等心肌損傷生物標(biāo)記物。通過(guò)Tunel染色檢測(cè)心肌組織及H9c2細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的比率。通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)水解的ca

7、spase-3蛋白的表達(dá)量。對(duì)H9c2細(xì)胞進(jìn)行AnnexinⅤ及PI共染色，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析其中凋亡細(xì)胞的比率。同時(shí)，為了明確番茄紅素對(duì)線粒體DNA以及線粒體功能的保護(hù)作用，也檢測(cè)了心肌組織及H9c2細(xì)胞中8-OHdG的含量，線粒體DNA拷貝數(shù)，線粒體DNA基因轉(zhuǎn)錄水平，線粒體膜電位以及細(xì)胞中ATP水平。
　　5.為了探討番茄紅素減輕線粒體DNA損傷的機(jī)制，對(duì)心肌組織及H9c2細(xì)胞中的MDA，ROS以及線粒體內(nèi)超氧化物含量進(jìn)行

8、了檢測(cè)。同時(shí)，為了進(jìn)一步明確番茄紅素保護(hù)線粒體DNA的作用是否與減輕氧化應(yīng)激有關(guān)，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中通過(guò)H2O2處理H9c2細(xì)胞，造成線粒體DNA的氧化損傷，觀察番茄紅素對(duì)H2O2引起的線粒體DNA損傷及線粒體功能障礙是否具有保護(hù)作用。
　　6.為了進(jìn)一步探討番茄紅素減輕線粒體DNA損傷的機(jī)制，我們還通過(guò)免疫印跡和免疫熒光染色的方法對(duì)線粒體轉(zhuǎn)錄因子（調(diào)節(jié)線粒體DNA拷貝、轉(zhuǎn)錄以及維持核樣結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵蛋白因子）進(jìn)行了檢測(cè)。
　　結(jié)果:

9、
　　1.在缺血/再灌注的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中都發(fā)現(xiàn)，缺血/再灌注導(dǎo)致了8-OHdG的大量生成，且大部分與線粒體重合。PCR的結(jié)果提示線粒體DNA拷貝數(shù)和基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低。這些結(jié)果表明心肌的缺血/再灌注損傷與線粒體DNA損傷有關(guān)。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，缺血/再灌注導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯降低。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，缺血/再灌注后H9c2細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低。這些結(jié)果表明缺血/再灌注引起了細(xì)胞線粒體功能障礙。<

10、br>　　3.為了明確線粒體DNA損傷與線粒體功能障礙的關(guān)系，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中通過(guò)向H9c2細(xì)胞加入低濃度的溴化乙錠的方法耗竭線粒體中的DNA，觀察其對(duì)線粒體功能及細(xì)胞存活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入溴化乙錠后細(xì)胞中線粒體DNA的拷貝數(shù)和基因轉(zhuǎn)錄水平隨著時(shí)間的推移逐漸降低，同時(shí)也觀察到細(xì)胞中ATP的水平及線粒體膜電位也逐漸降低，而線粒體中超氧物陰離子的濃度卻逐漸增加，細(xì)胞活力逐漸下降。這些結(jié)果表明線粒體DNA損傷可以導(dǎo)致線粒體功能障礙，細(xì)胞死亡。

11、
　　4.番茄紅素預(yù)處理能使大鼠心肌缺血/再灌注后的心臟梗死面積明顯減少，使血漿中的心肌損傷標(biāo)記物水平降低。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中番茄紅素能明顯抑制缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中都證明，番茄紅素能使Tunel陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)減少，使激活的caspase-3蛋白的表達(dá)量降低，使AnnexinⅤ染色陽(yáng)性的細(xì)胞比率降低，表明番茄紅素能夠抑制缺血/再灌注引起的細(xì)胞凋亡。同時(shí)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中都發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠有效的防止缺血/再灌

12、注引起的8-OHdG的生成以及線粒體DNA拷貝數(shù)與線粒體DNA基因轉(zhuǎn)錄水平的下降。番茄紅素還防止了缺血/再灌注引起的ATP水平的降低和線粒體膜電位的下降。這些結(jié)果表明番茄紅素可以通過(guò)保護(hù)線粒體DNA，減輕線粒體功能障礙，抑制細(xì)胞凋亡，來(lái)減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷。
　　5.線粒體DNA特別容易受到氧化應(yīng)激損傷。番茄紅素能夠明顯抑制缺血/再灌注引起的MDA以及活性氧的生成。番茄紅素也能夠抑制H2O2引起的線粒體DNA損傷及線粒體

13、功能障礙。
　　6.通過(guò)對(duì)與線粒體DNA的拷貝、轉(zhuǎn)錄以及維持核樣結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白因子Tfam的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注以后線粒體中Tfam的表達(dá)量明顯降低，而番茄紅素能有效的抑制線粒體中Tfam的下降。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:線粒體DNA損傷在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮了重要的作用;番茄紅素可通過(guò)保護(hù)線粒體DNA減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷，其保護(hù)線粒體DNA的作用可能與其減輕線粒體氧化應(yīng)激以及