西洋參莖葉總皂苷減輕心肌缺血-再灌注損傷的研究.pdf

1、盡早恢復(fù)組織血供，是目前防治心肌缺血損傷最有效的措施。但研究發(fā)現(xiàn)，缺血一定時(shí)間的心肌在重新恢復(fù)血液供應(yīng)后，損傷反而加重，出現(xiàn)心肌頓抑、心功能低下、惡性心律失常等，即心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。隨著急性心肌梗死(AMI)溶栓、經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成型術(shù)和冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)等再灌注療法的廣泛應(yīng)用，心肌再灌注損傷成為心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。
　　上世紀(jì)九十年代以來(lái)，我國(guó)對(duì)西洋參莖葉化學(xué)成

2、分和藥理學(xué)作用進(jìn)行了大量研究，表明其化學(xué)成分包括皂苷類(lèi)、氨基酸類(lèi)、糖類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、無(wú)機(jī)元素類(lèi)和脂肪酸類(lèi)等。西洋參莖葉總皂苷(panax quinquefolium saponins，PQS)是從西洋參莖葉中提取出的活性成分。研究顯示，PQS具有抗I/R心肌細(xì)胞凋亡、維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)等作用。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmie reticulum，ER)為細(xì)胞中調(diào)控蛋白質(zhì)折疊、Ca2+穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞器之一，對(duì)應(yīng)激非常敏感，缺血缺氧

3、、葡萄糖/營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)耗竭、大量自由基產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。一定程度的ERS通過(guò)上調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白類(lèi)(glucose-regulated proteins，GRPs)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)、蛋白質(zhì)折疊酶等促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)，持續(xù)或嚴(yán)重的E

4、RS則破壞細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)、上調(diào)促凋亡因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP)及caspase12的表達(dá)和活化，誘導(dǎo)ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡，加重I/R損傷。
　　本研究采用大鼠心肌I/R模型及心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型，模擬在體心肌I/R損傷，研究西洋參莖葉總皂苷保護(hù)心肌I/R

5、損傷的作用，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面，探討可能的分子機(jī)理。研究分為以下三個(gè)部分：
　　研究一西洋參莖葉總皂苷對(duì)于心肌缺血/再灌注損傷的影響
　　目的：觀(guān)察西洋參莖葉總皂苷(PQS)對(duì)心肌I/R損傷的作用。
　　方法：采用SD大鼠在體心臟I/R模型，檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)及血清心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)含量，以TTC和伊文思藍(lán)雙染法檢測(cè)心梗面積，采用HE和TUNEL法分別評(píng)估心肌病理?yè)p傷和心肌細(xì)胞

6、凋亡程度，采用Westernblot法檢測(cè)心肌組織凋亡調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。采用乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷模型，以臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)、乳酸脫氫酶活性以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞損傷及凋亡情況，以RT-PCR和Western blot方法，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與Sham組比較，I/R組平均動(dòng)脈壓升高55.0％(P<0.05)，左室收縮與舒張功能(±dp/dtmax)分別降低42.0％和

7、43.0％(P<0.05)，血清cTnT含量為Sham組的3.9倍(P<0.05)，梗死區(qū)心肌/缺血區(qū)面積(area of necrosis/area at risk，AN/AAR)百分比為(44.2±1.4)％，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)是Sham組的7.0倍(P<0.05)。病理觀(guān)察表明，心肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂，局部呈斷裂、壞死融合?？沟蛲龅鞍譈cl-2表達(dá)降低54.9％(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)是Sham組的3.9倍(P<0.05)；

8、與I/R組比較，PQS+I/R組平均動(dòng)脈壓降低32.0％(P<0.05)，左室+dp/dtmax分別升高64.0％和35.0％(P<0.05)，血清cTnT含量降低53.3％(P<0.05)，AN/AAR百分比降低65.5％(P<0.05)，心肌細(xì)胞凋亡率降低54.9％(P<0.05)；心肌組織病理?yè)p傷程度減輕；抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高110.0％(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)降低47.8％(P<0.05)。
　　(2

9、)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對(duì)照組比較，H/R組心肌細(xì)胞凋亡率升高5.0％(P<0.05)，細(xì)胞存活率降低21.7％(P<0.05)，LDH活性較對(duì)照組高約6.0倍(P<0.05)。Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)分別降低44.5％和58.3％(P<0.05)，Bax mRNA和蛋白表達(dá)分別升高86.9％和167.0％(P<0.05)；和H/R組比較，PQS+H/R組細(xì)胞凋亡率降低4.2％(P<0.05)，存活率升高21.2％(P<0.05)，LD

10、H活性降低66.6％(P<0.05)。Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)分別升高30.9％和48.0％(P<0.05)，Bax mRNA和蛋白的表達(dá)分別降低39.7％和48.4％(P<0.05)。
　　結(jié)論：PQS可減輕心肌缺血/再灌注損傷，其機(jī)制與增加抗凋亡因子Bcl-2和降低促凋亡因子Bax的表達(dá)有關(guān)。
　　研究二西洋參莖葉總皂苷減輕心肌缺血，再灌注損傷致嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究
　　目的：觀(guān)察西洋參莖葉總皂苷(PQS)

11、對(duì)心肌I/R損傷致嚴(yán)重ERS的影響。
　　方法：采用SD大鼠在體心臟缺血/再灌注(I/R)模型和乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型，以RT-PCR和Western blot方法，分別檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與Sham組比較，I/R組GRP78、CRT蛋白表達(dá)分別為Sham組的3.1倍和3.0倍(P<0.05)，CHOP蛋白表達(dá)為Sham組的3.4倍(P<0.05)，剪切后的caspas

12、e12的蛋白表達(dá)是Sham組的2.5倍(P<0.05)；與I/R組比較，PQS+I/R組CRT蛋白表達(dá)降低43.4％(P<0.05)，CHOP蛋白表達(dá)和剪切后的caspase-12蛋白表達(dá)分別降低38.6％和23.7％(P<0.05)。
　　(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對(duì)照組比較，H/R組GRP78 mRNA和蛋白的表達(dá)分別升高380.0％和142.0％(P<0.05)，CRT mRNA和蛋白的表達(dá)分別升高96.0％和312.0％(P<

13、0.05)；CHOP mRNA和蛋白的表達(dá)分別升高311.0％和219.0％(P<0.05)；剪切后的caspase-12蛋白表達(dá)升高180.0％(P<0.05)；與H/R組比較，PQS+H/R組GRP78 mRNA和蛋白的表達(dá)分別降低61.6％和37.7％(P<0.05)，CRT mRNA和蛋白的表達(dá)分別降低35.7％和52.2％(P<0.05)；CHOPmRNA和蛋白的表達(dá)分別降低57.0％和51.7％(P<0.05)；剪切后的ca

14、spase-12蛋白表達(dá)降低34.9％(P<0.05)。
　　結(jié)論：PQS可減輕心肌I/R誘導(dǎo)的嚴(yán)重ERS，表現(xiàn)為降低I/R后CRT的過(guò)表達(dá)，抑制CHOP、easpase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路的激活，減少過(guò)度ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　研究三西洋參莖葉總皂苷減輕心肌缺血/再灌注損傷致嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的下游信號(hào)通路研究
　　目的：探討西洋參莖葉總皂苷(PQS)減輕大鼠心肌I/R損傷致嚴(yán)重ERS的機(jī)制。
　　方法：采用

15、SD大鼠在體心臟缺血/再灌注(I/R)模型，檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)及血清cTnT含量，以TTC和伊文思藍(lán)雙染法檢測(cè)心梗面積，采用HE和TUNEL法分別評(píng)估心肌病理?yè)p傷和心肌細(xì)胞凋亡程度，按CaN測(cè)試盒步驟測(cè)定心肌CaN活性，采用Western blot法檢測(cè)心肌組織CaN蛋白表達(dá)；采用乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷模型，轉(zhuǎn)染pCDB-CaN質(zhì)?；駽aN抑制劑FK506干擾CaN表達(dá)，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按CaN測(cè)試盒步驟測(cè)定心肌細(xì)胞

16、CaN活性，以Western blot方法，檢測(cè)心肌細(xì)胞CaN表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與PQS+I/R組比較，CaN抑制劑(PQS+CaN+I/R)組平均動(dòng)脈壓、左室收縮舒張功能(±dp/dtmax)、血清cTnT含量、心梗面積、心肌細(xì)胞凋亡率、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表達(dá)、CaN活性及蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與PQS+H/R組比較，CaN抑制劑(FK506)