氫氣微泡減輕心肌缺血再灌注損傷的研究.pdf

1、目的：
　　1.探索脂質(zhì)微泡搭載氫氣以制作氫氣微泡的可行性;
　　2.探索氫氣微泡治療心肌缺血再灌注損傷的可能性及其機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)材料
　　實(shí)驗(yàn)儀器與試劑:制作脂質(zhì)微泡的磷脂材料DSPC、DSPE-PEG2000購(gòu)自美國(guó)Avanti公司，安全無(wú)菌，組織相容性好。全氟丙烷氣體購(gòu)自天津核工業(yè)理化工程研究院;氫氣購(gòu)自深圳市深特工業(yè)氣體有限公司，純度達(dá)99％以上;氫氣微電極系統(tǒng)購(gòu)自丹麥Uni

2、sense公司，此系統(tǒng)由化學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)處理系統(tǒng)和微操作系統(tǒng)三部分組成?；瘜W(xué)系統(tǒng)即是氫氣微電極，信號(hào)處理系統(tǒng)包括信號(hào)交換器和皮安表。其工作原理為氫氣經(jīng)擴(kuò)散作用經(jīng)過(guò)氫氣微電極的硅膜后，在傳感器的鉑陽(yáng)極處氧化產(chǎn)生電子流。在傳感器電子流從氧化的陽(yáng)極流向內(nèi)部的參比，同時(shí)皮安表獲得線(xiàn)性的氫氣分壓信號(hào)。此系統(tǒng)在水中檢測(cè)氫氣的極限濃度為0.3μM; VEVO2100小動(dòng)物超聲成像儀購(gòu)自VisualSonics公司，應(yīng)用與其配套的MS-250超聲探頭（中

3、心頻率21MHz，寬帶頻率13MHz～24 MHz，分辨率達(dá)到75微米，實(shí)時(shí)幀頻大于500fps），在M-MODE模式下測(cè)量大鼠的左室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短分?jǐn)?shù)。
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: SD雄性大鼠購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重250～300克，飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1 氫氣微泡的制備與表征
　　DSPC、DSPE-PEG2000以摩爾比9∶1，利用薄膜震蕩法制作氟氫比(C3F8/H2)為3∶0、

4、1∶1和0∶3的脂質(zhì)微泡。測(cè)量比較不同微泡的粒徑、濃度和含氫量，并在顯微鏡下觀(guān)察微泡的形態(tài)。挑選出含氧量高、粒徑和濃度均適宜的微泡做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　利用氫氣微電極系統(tǒng)檢測(cè)氫氣微泡在體外PBS溶液中和大鼠左心室腔內(nèi)隨時(shí)間的釋氫曲線(xiàn)。
　　將濃度為5×105、5×106、5×107、5×108、5×109/ml的氫氣微泡裝入橡膠袋中，應(yīng)用VEVO2100超聲成像儀對(duì)其進(jìn)行超聲成像，并測(cè)量每種微泡的視屏強(qiáng)度信號(hào)。將2×1010個(gè)氫

5、氣微泡經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi)，應(yīng)用VEVO2100超聲成像儀檢測(cè)左心室造影成像的效果，并繪制時(shí)間-視頻強(qiáng)度曲線(xiàn)。
　　2.2 動(dòng)物模型的制備及分組
　　取成年雄性SD大鼠麻醉后切斷左側(cè)第3或第4根肋骨，暴露心臟結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈形成心肌缺血，30分鐘后松開(kāi)結(jié)扎線(xiàn)形成再灌注。
　　所有大鼠隨機(jī)分為三組:
　?、偌偈中g(shù)組，只進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù)，不進(jìn)行缺血操作;
　　②普通微泡組，再灌注前5分鐘經(jīng)尾靜脈注入一定量未載氫氣的普

6、通微泡;
　?、蹥錃馕⑴萁M，再灌注前分鐘經(jīng)尾靜脈注入一定量氫氣微泡。
　　為研究心肌梗死面積與氫氣微泡劑量的關(guān)系，在②、③組中另設(shè)高劑量組和低劑量組。高劑量，每只大鼠注入2×1010個(gè)微泡;低劑量，每只大鼠注入4×109個(gè)微泡。
　　2.3 缺血區(qū)及梗死區(qū)面積的測(cè)量
　　再灌注24小時(shí)后開(kāi)胸拉緊結(jié)扎線(xiàn)形成與之前相同的心肌缺血，經(jīng)尾靜脈注入伊文思藍(lán)染液以區(qū)分缺血區(qū)與非缺血區(qū)。迅速處死大鼠后取心臟沿短軸位做切片，進(jìn)行

7、TTC染色，以區(qū)分梗死區(qū)與非梗死區(qū)。測(cè)量梗死區(qū)的面積(INF)、缺血區(qū)面積(AAR)和左心室的面積(LV)，并計(jì)算AAR/LV、INF/AAR及INF/LV。
　　2.4 超聲心動(dòng)圖測(cè)定大鼠心肌功能
　　再灌注24小時(shí)后，用VEVO2100小動(dòng)物超聲成像儀測(cè)量各組大鼠的左室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短分?jǐn)?shù)，以評(píng)價(jià)各組大鼠的心功能。
　　2.5 H&E染色觀(guān)察各組大鼠的心肌結(jié)構(gòu)變化
　　再灌注24小時(shí)后，取大鼠心臟做石蠟切片

8、，進(jìn)行H&E染色，顯微鏡下觀(guān)察各組大鼠的心肌結(jié)構(gòu)。
　　2.6 TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡
　　再灌注24小時(shí)后，取大鼠心臟做石蠟切片，利用TUNEL法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。
　　2.7 炎性因子TNF-α，IL-1β的檢測(cè)
　　再灌注24小時(shí)后，取大鼠心臟作組織勻漿，ELISA法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中炎性因子TNF-α，IL-1β的含量。
　　2.8 活性氧H2O2、NO·、·OH及O2-·的檢測(cè)<

9、br>　　再灌注40分鐘后，取大鼠心臟作組織勻漿，迅速與CM-H2DCFDA、DAF-2DA、HPF及MitoSOX指示劑反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定各自的熒光強(qiáng)度以計(jì)算各自的濃度。
　　2.9 毒性實(shí)驗(yàn)
　　取健康SD大鼠3只，注射氫氣微泡前經(jīng)尾靜脈抽取大鼠血液100μl，注射氫氣微泡后第3、7天再分別取血液100μl。用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)大鼠血液樣品進(jìn)行分析。第7天取完血液后，離頸處死并取大鼠的心、肝、脾、肺、腎做石蠟切片，行H&

10、E染色，觀(guān)察其結(jié)構(gòu)改變。并用3只未注射氫氣微泡的健康大鼠作對(duì)照。
　　2.10 統(tǒng)計(jì)方法
　　所有結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，心肌梗死面積、左心室功能的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，心肌細(xì)胞凋亡、炎癥因子、活性氧的比較采用One-way ANOVA分析，組間多重比較用Bonferroni法。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS13.0軟件，并以P＜0.05作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1.成功制得不同C3F8/H2的氫氣微

11、泡，其中C3F8/H2為1∶1的氫氣微泡的含氫量最高，達(dá)(1.46±0.08)μmol/ml，微泡的平均粒徑為(0.89±0.03)μm，濃度為(2.29±0.07)×1010/ml。光鏡下微泡呈中心透亮的球形，大小較均勻。
　　2.氫氣微泡在體外PBS溶液及體內(nèi)左心室腔內(nèi)均能自發(fā)釋放氫氣。
　　3.氫氣微泡在體外、體內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)超聲增強(qiáng)造影成像。
　　4.與普通微泡組相比，氫氣微泡組大鼠心肌梗死而積顯著減小(P＜0.0

12、5)。高劑量的氫氣微泡與低劑量相比，其心肌梗死面積更小(P＜0.01)，對(duì)心肌的保護(hù)作用更顯著。
　　5.與普通微泡組相比，氫氣微泡組的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減小，顯微鏡下氫氣微泡組大鼠的心肌結(jié)構(gòu)明顯好于普通微泡組。同時(shí)，氫氣微泡組EF、FS均明顯高于普通微泡組(P＜0.05)，說(shuō)明氫氣微泡能保護(hù)缺血再灌注損傷后的心肌功能。
　　6.與普通微泡組相比，氫氣微泡組大鼠心肌組織中炎性因子TNF-α、IL-1β的含量明顯減低，說(shuō)明氫氣

13、微泡能顯著緩解心肌的炎癥反應(yīng)。
　　7.與普通微泡組相比，氫氣微泡組大鼠心肌組織中·OH含量顯著降低，而H2O2、 NO·及O2-·含量未見(jiàn)明顯差異。
　　8.注射氫氣微泡前及注射后3、7天大鼠的血常規(guī)檢查各項(xiàng)指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)。大鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要內(nèi)臟器官組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常改變。
　　結(jié)論：
　　1.脂質(zhì)微泡可以包裹氫氣，是一種理想的氫氣載體。
　　2.氫氣微泡可顯著減少心肌缺血再灌注后心肌