虎狀苷后處理促進(jìn)自噬流減輕心肌缺血再灌注損傷.pdf

1、目的：
　　1.在動(dòng)物心肌缺血再灌注模型及原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型中，證實(shí)虎杖苷在心肌缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用。
　　2.在原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型中，探究虎杖苷在心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選用野生型C57BL/6雄性小鼠(6至8周齡，體重20-25g)，小鼠心肌缺血再灌注損傷模型的構(gòu)建是結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30分鐘后解除結(jié)扎線進(jìn)行2小時(shí)灌注。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)包括使用不同虎杖苷濃度的預(yù)

2、實(shí)驗(yàn)，及選取最佳濃度后的正式實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)對(duì)象被隨機(jī)分成5組:假手術(shù)組（sham組）、缺血再灌注加生理鹽水組（I/R+NS組）、缺血再灌注加5 mg/kg虎杖苷組（I/R+PD5組）、缺血再灌注加7.5 mg/kg虎杖苷組（I/R+PD7.5組）、缺血再灌注加10 mg/kg虎杖苷組（I/R+PD10組）。用TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平及用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)各組中自噬相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。確定虎杖苷最佳藥物劑量

3、7.5mg/kg后，小鼠被隨機(jī)分成組:假手術(shù)組（sham組）、缺血再灌注加生理鹽水組（I/R+NS組）、缺血再灌注加虎杖苷組（I/R+PD組）、缺血再灌注加虎杖苷加自噬抑制劑組（I/R+PD+3-MA組）、缺血再灌注加自噬抑制劑組I/R+3-MA組）。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30分鐘后解除結(jié)扎線再灌注2小時(shí)，建立小鼠心肌缺血再灌注模型。于結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支15分鐘后，通過(guò)腹腔注射一定濃度的藥物（生理鹽水或虎杖苷或自噬抑制劑）。提取各組心臟

4、組織進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，用TTC-Evans blue雙染檢測(cè)心肌梗死面積，用小動(dòng)物超聲技術(shù)檢測(cè)心臟功能。
　　體外實(shí)驗(yàn)是在SD大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞中，模擬體內(nèi)心肌缺血再灌注過(guò)程，建立原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型。本實(shí)驗(yàn)主要采用胰酶膠原酶消化法獲取乳鼠原代心肌細(xì)胞，通過(guò)差速培養(yǎng)法及Brdu抑制法抑制成纖維細(xì)胞，分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（control組）、缺氧復(fù)氧組（H/R組

5、）、缺氧復(fù)氧加1μM虎杖苷組（H/R+PD1組）、缺氧復(fù)氧加10μM虎杖苷組（H/R+PD10組）、缺氧復(fù)氧加100μM虎杖苷組（H/R+PD100組）。觀察心肌細(xì)胞搏動(dòng)和形態(tài)學(xué)變化;用MTS法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力;用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)各組中自噬相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。確定虎杖苷最佳濃度為10μM后，設(shè)定以下實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組（control組）、缺氧復(fù)氧組(H/R組)、缺氧復(fù)氧加虎杖苷組（H/R+PD組）、缺氧復(fù)氧加虎杖苷加自噬

6、抑制劑組（H/R+PD+3-MA或H/R+PD+ Bafilomycin A1組）、缺氧復(fù)氧加自噬抑制劑組（H/R+3-MA或H/R+ Bafilomycin A1組）。提取各組細(xì)胞蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡分析;用GFP-mRFP雙標(biāo)LC3的腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，檢測(cè)自噬流的水平;用TUNEL染色法分析細(xì)胞凋亡水平;用電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);分別用JC-1染色及Rho123染色后共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體損傷水平;分別用DCFH-

7、DA及DHE熒光探針標(biāo)記后，使用共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中活性氧的水平。此外，在原代心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1使之表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證原代心肌細(xì)胞中自噬及凋亡的水平。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度虎杖苷后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的作用
　　(1)虎杖苷后處理增加心肌細(xì)胞存活率。細(xì)胞活性經(jīng)Levene法方差分析顯示方差齊(P=0.052);用LSD法進(jìn)行組間比較。H/R組與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率明顯

8、減少（P＜0.001 vs.C組，n=3）;虎杖苷各濃度處理組與H/R組相比，細(xì)胞存活率明顯增加（P＜0.001 vs.H/R組）。高濃度組與中濃度組中細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.0，PD10 vs.PD100組）。
　　(2)虎杖苷后處理減少小鼠心肌細(xì)胞凋亡。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)經(jīng)Levene法方差分析顯示方差不齊(P＜0.001);用Welch法進(jìn)行近似方差分析(P＜0.001)。I/R組與假手術(shù)組相比，TUNEL陽(yáng)性

9、細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.001 vs.sham組，n=40，每組四只，每只選取10個(gè)視野）;虎杖苷各濃度處理組與I/R組相比，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.001 vs.I/R組）。高濃度組與中濃度組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.999)。
　　(3)虎杖苷后處理使心肌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增加，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)減少。
　　結(jié)果表明:各濃度PD均能減輕心肌細(xì)胞凋亡，增加存活率，并增加自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

10、，減少凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，綜合以上結(jié)果，分別選取10μ M及7.5 mg/kg作為體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的最佳濃度。
　　2.虎杖苷后處理對(duì)缺血再灌注損傷起保護(hù)作用
　　(1)虎杖苷后處理減少小鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷及線粒體腫脹。電子顯微鏡結(jié)果顯示對(duì)照組中線粒體結(jié)構(gòu)完整，線粒體脊排列完整;而缺血灌注組中可見(jiàn)線粒體明顯腫脹，可見(jiàn)線粒體脊部分消失;虎杖苷后處理明顯改善線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷，腫脹的線粒體體積縮小，線粒體脊排列較完整。線粒體平均面

11、積經(jīng)Levene法方差分析顯示方差不齊(P＜0.001，);用Welch法進(jìn)行近似方差分析(P＜0.001)。I/R組與sham組相比，線粒體平均面積明顯增加(P＜0.001 vs.sham組， n=40);PD后處理組明顯減少線粒體平均面積(P＜0.001，I/R+PD vs.I/R+NS組)。加入自噬抑制劑3-MA后，線粒體平均面積增加（P＜0.001，I/R+3-MA+PD vs.I/R+PD組）。
　　(2) PD后處理明

12、顯減少心肌梗死面積。
　　(3) PD后處理明顯改善心功能。
　　虎杖苷后處理增加自噬表達(dá)水平。
　　結(jié)果表明:PD后處理能改善缺血再灌注損傷引起的超微結(jié)構(gòu)損傷，能減少梗死面積，明顯改善心功能。
　　3.虎杖苷后處理對(duì)自噬及凋亡的影響
　　(1)虎杖苷后處理增加自噬，抑制凋亡。
　　(2)自噬抑制劑部分抵消虎杖苷后處理引起的細(xì)胞保護(hù)作用。
　　細(xì)胞活性經(jīng)Levene法方差分析顯示方差齊(P=0.

13、286);用LSD法進(jìn)行組間比較。轉(zhuǎn)染Beclin1干擾病毒組與陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率明顯減少(P＜0.001 vs.NC組， n=3)。
　　4.虎杖苷后處理促進(jìn)自噬流的順利進(jìn)行
　　自噬的發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，自噬發(fā)生的過(guò)程包括自噬前體的形成，自噬體的形成，自噬體與溶酶體的融合以及自噬溶酶體的降解。自噬的表達(dá)增加可能是自噬體形成的增加或者是自噬溶酶體降解的減少，為進(jìn)一步驗(yàn)證虎杖苷主要影響的是自噬發(fā)生的哪個(gè)過(guò)程。我們?cè)?/p>

14、原代心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染攜帶GFP-mRFP-LC3的腺病毒，觀察自噬體(AP)及自噬溶酶體(AL)的變化。AP數(shù)量經(jīng)Levene法方差分析顯示方差不齊(P＜0.001);用Welch法進(jìn)行近似方差分析(P＜0.001)。H/R組與對(duì)照組相比，AP數(shù)量明顯增加(P＜0.001 vs.C組， n=40)。AL經(jīng)Levene法方差分析顯示方差不齊(P＜0.001，);用Welch法進(jìn)行近似方差分析(P＜0.001)。H/R+PD組與H/R組相比，

15、自噬體數(shù)量明顯增加(P＜0.001 vs.H/R組， n=40)。加入自噬體抑制劑3-MA后，AP及AL均明顯減少（P＜0.001，H/R+3-MA+ PD vs.H/R+PD組）。為進(jìn)一步驗(yàn)證虎杖苷影響自噬發(fā)生的過(guò)程，我們?cè)谛募〖?xì)胞中加入溶酶體抑制劑（Bafilomycin A1）。Western blot結(jié)果顯示加入Bafilomycin A1后，蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ的水平均明顯增加（P＜0.001，H/R+Baf vs.H/

16、R+PD+Baf組），說(shuō)明虎杖苷主要促進(jìn)AL的降解，即促進(jìn)自噬流的發(fā)生。并用TUNEL方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平。TUNEL經(jīng)Levene法方差分析顯示方差不齊(P＜0.001，);用Welch法進(jìn)行近似方差分析(P＜0.001)。H/R組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡增加(P＜0.001 vs.C組， n=40)。虎杖苷減少細(xì)胞凋亡（P＜0.001 vs.H/R組），溶酶體抑制劑Bafilomycin A1則抵消虎杖苷的部分保護(hù)作用（P＜0.00

17、1，H/R+Baf vs.H/R+PD+Baf組）。
　　結(jié)果表明:虎杖苷后處理促進(jìn)自噬流的發(fā)生，并減少細(xì)胞凋亡。
　　5.虎杖苷后處理對(duì)線粒體及ROS水平的影響。
　　5.1虎杖苷后處理對(duì)線粒體的影響
　　自噬發(fā)生時(shí)能夠包裹損傷的線粒體，通過(guò)降解損傷的線粒體等并轉(zhuǎn)化為能量，為周邊的細(xì)胞提供能量。結(jié)果顯示虎杖苷增加自噬流的發(fā)生，則進(jìn)一步檢測(cè)虎杖苷后處理后對(duì)損傷線粒體的影響。
　　5.2虎杖苷后處理對(duì)ROS水