七氟醚后處理減輕離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 七氟醚后處理減輕離體大鼠心肌缺血再灌注損傷
　　目的：通過對比心肌I/R前后血液動力學(xué)參數(shù)、凋亡和梗死面積，探討七氟醚后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。
　　方法：建立大鼠心臟Langendorff離體心臟灌流模型，取制備離體模型成功的心臟32個，分為4組(n=8):假手術(shù)組（SHAM組），單純七氟醚組（S組），單純?nèi)毖俟嘧⒔M（I/R組），七氟醚后處理組（SEVO

2、P組）。(1)SHAM組:K-H液持續(xù)灌注180 min;(2)S組:K-H液持續(xù)灌注60 min，且于60min時給予含2.5％七氟醚（批號:2217，丸石制藥株氏會社，日本）的K-H液灌注15 min，繼續(xù)K-H液灌注105 min;(3)I/R組:平衡30 min，缺血30 min，再灌注120 min;(4)SEVOP組:于再灌注初給予含2.5％七氟醚的K-H液灌注15 min;記錄各組血液動力學(xué)參數(shù);TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡部

3、分;TTC法計算心肌梗死面積;Western blot測Bcl-2、Caspase-3的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：與T0比，I/R和SEVOP組在T1、T2、T3、T4時點LVSP、HR、±dp/dtmax、降低(P＜0.05)，LVEDP升高(P＜0.05);在T1、T2、 T3、 T4時刻，與SHAM組比較，I/R和SEVOP組LVSP、HR、±dp/dtma降低，LVEDP升高(P＜0.05);與I/R組比較，SEVOP組LVS

4、P、HR、±dp/dtma升高，LVEDP降低(P＜0.05)。與I/R組（51±5）％相比，SEVOP組（31±4）％的心肌梗死范圍縮小(P＜0.05)。TUNEL法染色結(jié)果示，與SHAM組相比，I/R組及SEVOP組心肌細(xì)胞TUNEL染色陽性細(xì)胞增多，TUNEL凋亡指數(shù)增高(P＜0.05);與I/R組比，SEVOP組心肌細(xì)胞TUNEL染色陽性細(xì)胞較少，凋亡指數(shù)較低(P＜0.05)。與SHAM組相比，I/R組及SEVOP組心肌Bcl-

5、2蛋白表達(dá)下降，Caspase-3表達(dá)增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。(P＜0.05);與I/R組比，SEVOP組心肌Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Caspase-3表達(dá)下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。(P＜0.05)
　　結(jié)論：七氟醚后處理后大鼠左室舒張功能增加，心肌收縮力增強，心功能改善明顯;七氟醚后處理能抑制心肌細(xì)胞凋亡，減小梗死面積，減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。
　　第二部分 七氟醚后處理減輕離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的分子機制:NOS/

6、NO-NHE1-MPTP途徑
　　目的：通過心肌I/R后，七氟醚后處理，用或不用L-NAME后NOS/NO、NHE1/p-NHE1和NAD+含量變化，探討七氟醚后處理離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用的分子機制。
　　方法：Langendorff灌流模型成功的雄性SD大鼠離體心臟72個，采用隨機數(shù)字表法，將其分為6組（n=12）:假手術(shù)組（S組）:連續(xù)用K-H液灌注180 min;七氟醚組(Sev組):K-H液灌注60 m

7、in后，用含2.5％七氟醚的K-H液灌注15 min，再用K-H液灌注105 min;缺血再灌注組(I/R組):K-H液灌注30 min后，停灌30 min，再灌注120min，制備心肌缺血再灌注損傷模型;七氟醚后處理組(SEVOP組):K-H液灌注30 min后，停灌30 min，于再灌注開始即刻用含2.5％七氟醚的K-H液灌注15 min，隨后再用K-H液灌注105 min;七氟醚后處理+NOS抑制劑旋硝基精氨酸甲基酯(L-NAME

8、)組(SEVOP+L-NAME組):再灌注開始用含濃度為100μmol/L L-NAME的K-H液灌注60 min（再灌注開始同時注入K-H液2.5％七氟醚并維持15分鐘），隨后再K-H液灌注60 min; NOS抑制劑旋硝基精氨酸甲基酯(L-NAME)組（L組）:再灌注開始即刻用含濃度為100μmol/L L-NAME的K-H液灌注60 min，再換用上述單純K-H液灌注60 min;于再灌注2h時取心肌組織，采用分光光度法檢測NO、

9、NAD+含量和NOS活性，Western Blot法測定總NHE1(t-NHE1)和磷酸化NHE1(p-NHE1)的表達(dá)，RT-PCR法測定NHE1 mRNA的表達(dá)水平，并測定心肌梗死體積，觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：與S組比較，I/R組、SEVOP組、SEVOP+L-NAME組和L組心肌梗死體積增大，心肌組織NO、NOS和NAD+水平降低，p-NHE1及NHE1 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），Sev組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意

10、義(P＞0.05);與I/R組比較，SEVOP組心肌梗死體積減小，心肌組織NO、NOS和NAD+水平升高，p-NHE1及NHE1 mRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，SEVOP+L-NAME組和L組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與SEVOP組比較，SEVOP+L-NAME組和L組心肌梗死體積增大，心肌組織NO、NOS和NAD+水平降低，p-NHE1及NHE1 mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。SEVOP組心肌病理學(xué)損傷較I/R

11、組和SEVOP+L-NAME組減輕。
　　結(jié)論：七氟醚后處理可能通過增強心肌NOS活性，促進NO合成，抑制NHE1功能，減少MPTP開放，從而減輕大鼠離體心臟缺血再灌注損傷。
　　第三部分 七氟醚后處理對離體大鼠缺血再灌注心肌脹亡和自噬的影響
　　目的：觀察七氟醚后處理對大鼠心肌脹亡和自噬活動的影響。
　　方法：建立大鼠心臟Langendorff離體心臟灌流模型，取制備離體模型成功的心臟32個，分為4組(n=8)

12、:假手術(shù)組（SHAM組），單純七氟醚組（S組），單純?nèi)毖俟嘧⒔M（I/R組），七氟醚后處理組（SEVOP組），各組處理方法同第一部分。透射電鏡觀察細(xì)胞脹亡和自噬;Western blot測自噬相關(guān)分子LC3Ⅰ、LC3Ⅱ，Beclin-1和脹亡相關(guān)分子porimin的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：Sham組自噬小體數(shù)目是1.2±0.7，脹亡細(xì)胞數(shù)是3.2±1.5;S組自噬小體的數(shù)目是1.0±0.6，脹亡細(xì)胞數(shù)是3.0±1.3，兩組對比，無統(tǒng)

13、計學(xué)差異。而在缺血再灌注組，I/R組自噬小體數(shù)目是10.4±2.4，脹亡細(xì)胞數(shù)是15.5±4.2;七氟醚后處理組SEVOP組自噬小體的數(shù)目是6.8±1.8，脹亡細(xì)胞數(shù)是11.7±3.5表明缺血再灌注后自噬小體和脹亡細(xì)胞數(shù)目顯著增加，而七氟醚后處理能顯著減少噬小體和脹亡細(xì)胞生成的數(shù)目。
　　結(jié)論：單獨使用七氟醚不影響自噬小體和脹亡細(xì)胞數(shù)目，缺血再灌注后自噬小體和脹亡細(xì)胞數(shù)目顯著增加，而七氟醚后處理能顯著減少自噬小體和脹亡細(xì)胞生成的數(shù)