黃芩素靶向MD2保護(hù)心肌缺血-再灌注損傷的機(jī)制研究.pdf

1、第一章黃芩素通過MD2減輕TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷
　　目的:探討天然產(chǎn)物黃芩素減輕TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的機(jī)制，探尋黃芩素減輕TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的靶點(diǎn)，闡明MD2在TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷過程中的作用。
　　方法:體外培養(yǎng)大鼠心肌H9C2細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃芩素對(duì)TBHP誘導(dǎo)的大鼠心肌H9C2細(xì)胞凋亡的影響，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黃芩素對(duì)H9C2細(xì)胞的毒性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃芩素預(yù)處理后TBHP誘

2、導(dǎo)的H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS，WST法檢測(cè)大鼠心肌H9C2細(xì)胞內(nèi)SOD，應(yīng)用MDA試劑盒檢測(cè)心肌H9C2細(xì)胞內(nèi)MDA，ELISA法檢測(cè)TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥因子水平，流式細(xì)胞儀和JC-1熒光染色法檢測(cè)TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞線粒體膜電位變化，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞細(xì)胞色素C釋放和NF-κB核轉(zhuǎn)移，western blot檢測(cè)凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)。體外H9C2細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的H9C2

3、細(xì)胞炎癥因子水平。采用表面等離子共振技術(shù)(SPR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了黃芩素是否能與MD2蛋白發(fā)生直接結(jié)合;采用計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接技術(shù)觀察黃芩素與MD2的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合方式;bis-ANS熒光光譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黃芩素與MD2的親和力;免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)黃芩素對(duì)TBHP誘導(dǎo)的MD2/TLR4復(fù)合物的影響。體外培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，通過Lipo2000脂質(zhì)體將MD2 SiRNA轉(zhuǎn)染入H9C2細(xì)胞內(nèi)，24 h后用Western Blot技術(shù)驗(yàn)證MD2沉默效果。E

4、LISA法檢測(cè)沉默MD2基因后TBHP刺激H9C2細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)基中的炎癥因子水平。WST法檢測(cè)沉默MD2基因后TBHP刺激H9C2細(xì)胞內(nèi)的SOD。流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)沉默MD2、沉默TLR4和沉默MD2+TAK后TBHP刺激H9C2細(xì)胞內(nèi)的ROS。流式細(xì)胞儀檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞MD2基因沉默及加入TAK后細(xì)胞內(nèi)ROS。
　　結(jié)果:黃芩素減輕TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡;黃芩素對(duì)H9C2細(xì)胞的IC50為134.7μM，毒性小;黃

5、芩素減輕TBHP刺激H9C2細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng);黃芩素減少TBHP刺激H9C2細(xì)胞引起NF-κB P65核轉(zhuǎn)移，保護(hù)TBHP刺激H9C2細(xì)胞引起的線粒體膜電位下降，減少TBHP刺激H9C2細(xì)胞引起的線粒體細(xì)胞色素C的釋放，減少凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)。表面等離子共振技術(shù)(SPR)結(jié)果表明黃芩素能與MD2發(fā)生直接相互作用，計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)黃芩素嵌入到MD2蛋白疏水性口袋中，并且與MD2口袋中的Tyr102形成氫鍵

6、作用，bis-ANS熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)隨著黃芩素濃度的增加，bis-ANS與MD2蛋白結(jié)合的熒光強(qiáng)度逐漸下降;免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也表明黃芩素的加入能夠降低LPS誘導(dǎo)的MD2/TLR4復(fù)合物的形成。沉默MD2后TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥因子釋放減少，細(xì)胞內(nèi)ROS降低，SOD升高。MD2沉默和TLR4抑制劑協(xié)同減低TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS。沉默MD2減低TBHP誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞內(nèi)ROS。
　　結(jié)論:黃芩素通過降低NOX

7、4的表達(dá)從而減輕TBHP刺激H9C2細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激;通過減少NF-κB P65的核轉(zhuǎn)移減輕TBHP刺激H9C2細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激;黃芩素減輕TBHP誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙。黃芩素的作用靶點(diǎn)是MD2蛋白;MD2基因沉默減輕TBHP刺激H9C2細(xì)胞引起的炎癥和氧化應(yīng)激。
　　第二章黃芩素通過MD2減輕小鼠心肌缺血/再灌注損傷
　　目的:動(dòng)物層面驗(yàn)證黃芩素減輕小鼠心肌缺血/再灌注損傷的機(jī)制，進(jìn)一步闡明MD

8、2在心肌缺血/再灌注損傷病理過程中的作用。
　　方法:建立小鼠心肌缺血/再灌注模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只正常C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組（Sham組）、模型組（I/R組）、黃芩素15 mg/kg+I/R組、黃芩素30 mg/kg+I/R組，每組10只。20只C57BL/6MD2-/-小鼠隨機(jī)分為2組:假手術(shù)組（MD2-/-Sham組）、模型組(MD2-/-I/R組)，每組10只。給藥組（黃芩素15 mg/kg+I/

9、R組、黃芩素30 mg/kg+I/R組）在造模前2h經(jīng)小鼠尾靜脈注入對(duì)應(yīng)濃度的黃芩素。假手術(shù)組暴露小鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，但不結(jié)扎，模型組和給藥組小鼠左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線恢復(fù)血流灌注4h。處死小鼠，收集小鼠靜脈血和心尖部心肌組織標(biāo)本。用TTC/Evances blues雙染色法測(cè)量并計(jì)算不同組別小鼠心肌梗死面積(IFN)、心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)域面積(AAR)，計(jì)算IFN/AAR;用TUNEL試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡情況;

10、利用肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測(cè)小鼠血清CK-MB和LDH水平;利用ELISA技術(shù)分別考察小鼠心肌組織中TNF-α、IL-6水平，檢測(cè)小鼠心肌組織中SOD和MDA水平;應(yīng)用免疫熒光技術(shù)考察小鼠心肌組織NF-κB p65亞單位入核情況;心肌組織勻漿離心后應(yīng)用Western Blot技術(shù)分別考察不同組別小鼠心肌組織氧化還原代謝關(guān)鍵酶(NOX4)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路上的關(guān)鍵酶(ATF4、ATF6、p-eIFα、

11、CHOP)及凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白(Bcl-2、BAX、cle-caspase3、cle-caspase9)的表達(dá);應(yīng)用免疫組化技術(shù)分別考察不同組別小鼠心肌組織NOX4、CHOP、cle-caspase3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:黃芩素和MD2基因敲除減少小鼠心肌缺血/再灌注損傷后的心肌梗死面積，減輕小鼠心肌缺血/再灌注損傷后的心肌凋亡，降低血清CK-MB和LDH水平，減輕小鼠心肌缺血/再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減少小鼠心肌缺血