P-選擇素靶向超聲分子成像評價心肌缺血再灌注損傷.pdf

1、背景和目的： 心肌缺血再灌注損傷（IRI）常見于急性冠脈綜合癥、心絞痛患者，是冠脈介入術后常見的病理生理現象，也是導致心力衰竭的主要損傷環(huán)節(jié)。而相關研究表明，38％的發(fā)生急性心肌缺血事件的患者常常會由于傳統臨床檢測手段如心電圖、早期血清心肌酶標記物等檢查結果不具診斷性導致診斷延遲，甚至漏診。超聲心動圖的室壁運動分析和對比超聲灌注成像雖然能夠提供一些額外的信息來指導臨床治療，但其對于心肌缺血再灌注損傷的檢測提供的指導信息有限。因此

2、，如果能夠發(fā)展一種技術檢測手段，在心肌缺血事件發(fā)生之后仍能夠依靠對“缺血記憶”成像對曾發(fā)生缺血事件的心肌部位和范圍做出評價，這無疑具有重大臨床意義。 材料和方法： 1．超聲微泡的制備：各種相關脂質材料按一定質量比例75℃水浴溶解于適量蒸餾水中，同時通全氟丙烷（C3F8）氣體，超聲振蕩至形成乳白色液體制備普通脂質微泡或生物素（biotin）化脂質微泡（MB）。MB經靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結合脂質純化1次后，按一

3、定比例加入抗生蛋白鏈菌素（streptavidin）。繼續(xù)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結合抗生蛋白鏈菌素純化微泡1次后，按一定比例加入生物素化的抗小鼠P-選擇素單克隆抗體（biotin conjugated rat anti-mouse P-selectin monoclone antibody）和同型對照抗體（isotype control antibody），分別得到攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡（MBp）和同型對照微泡（MBc

4、），最后靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結合抗體純化微泡1次，冰箱中4℃保存?zhèn)溆?。采用庫爾特計數儀測量超聲微泡的平均粒徑及濃度。 2．攜熒光FITC超聲微泡的制備：MB經靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結合脂質純化1次后，按一定比例加入FITC-抗生蛋白鏈菌素（streptavidin），得到攜熒光FITC的MB。繼續(xù)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結合FITC-抗生蛋白鏈菌素抗生蛋白鏈菌素純化微泡1次后，按一定比例加入生

5、物素化的抗小鼠P-選擇素單克隆抗體，得到攜帶熒光FITC的MBp，最后靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結合抗體純化微泡1次，冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?3．超聲微泡體外評價：采用綠色熒光標記的二抗與抗P-選擇素單抗結合熒光顯微鏡下觀察抗P-選擇素單抗與微泡的連接情況。 4．超聲微泡體內評價：應用攜熒光FITC的超聲微泡和熒光顯微鏡相結合，直視下觀察超聲微泡在小鼠提睪肌微循環(huán)中的行為特征，并對超聲微泡粘附途徑/效能進行評價。

6、 5．動物模型的制備和分組： 5．1．提睪肌炎癥模型的制備：20只實驗小鼠隨機分為2組，對照組和TNF-α（tumor necrosis factor-α）處理組。構建小鼠的提睪肌炎癥模型后，再根據隨機注射超聲微泡的不同，分為MBp組和MB組。所有小鼠采用戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉后，將小鼠仰臥位固定四肢于自制平臺的透明墊上，尾靜脈插管用于微泡的注入。TNF-α處理組以TNF-α50ug稀釋到0．3ml

7、的鹽水中，陰囊注入。2小時后分離出提睪肌，并將其最大程度的平鋪在自制平臺的透明墊上，然后將透明墊鼠板放置于熒光顯微鏡上。實驗過程中用恒溫平衡克氏液持續(xù)緩慢滴在提睪肌上。 5．2．心肌缺血再灌注模型的制備：10只實驗小鼠常規(guī)麻醉后，尾靜脈插留置針用于注射微泡。經胸骨左側第四肋間開口，鈍性分離皮下肌肉，暴露心臟，結扎左前降支血管。實驗過程中心電圖實時監(jiān)視，以心電圖ST段抬高≥0．1mv作為模型成功標志。結扎10min后，去除塑料管，

8、撤掉結扎線。以ST段恢復正常作為再灌注模型成功標志。10只心肌缺血再灌注小鼠先后隨機注入MBp和MBc后行MCE檢查，并根據注入超聲微泡的不同分為MBp組和MBc組。 6．超聲微泡粘附性能評價：小鼠提睪肌炎癥模型建立后，尾靜脈注入5×106個MBp或MB，用適于觀察熒光標記脂質微泡（470-490nm）的熒光過濾器和高分辨率制冷相機記錄5min內20高倍鏡視野下MBp或MB在微循環(huán)（主要是20-40μm的小靜脈）中的粘附數量和粘

9、附途徑；采集熒光標記脂質微泡熒光和常光下在血管內的粘附圖像，存于個人計算機，并對不同粘附途徑的微泡數量進行分類匯總。 7．心肌MCE檢查及圖像分析：動物模型制備后，用支架固定超聲探頭（17L5）于小鼠心腔上方，調整探頭位置獲得良好的左室短軸切面顯像后保持探頭位置在整個實驗過程中不變，儀器的各項參數在整個實驗過程中不變。灌注成像和MCE檢查均采用相干脈沖序列成像技術（Coherent Pulse Sequence，CPS）成像方式

10、實時觀察，探頭發(fā)射頻率為7．0MHZ，機械指數（MI）為0．2。灌注成像：結扎小鼠冠脈后，靜脈注入5×105個MB，評價心肌灌注缺損區(qū)域。靶向超聲成像：每只小鼠采用微量進樣器經尾靜脈隨機（間隔30min）先后注射MBc和MBp的數量約為1×106個。在注入微泡5min后行MCE，獲取第一幀圖像后給予高MI的連續(xù)超聲發(fā)射2-3s以破壞微泡，繼續(xù)存儲本底圖像2-3幀，全部聲學造影圖像存于CD盤，以備脫機分析。第一幀圖像聲強度（Ⅵ，視頻密度）

11、可代表靶向微泡在組織中的總濃度，包括粘附和循環(huán)微泡。微泡破壞后存儲圖像上的Ⅵ反應的是在血池中循環(huán)微泡的濃度。前者減去后者得到的是粘附微泡在組織中的濃度。取圖結束后，應用MCE圖像分析軟件對圖像進行分析，測量小鼠心臟造影的Ⅵ值，并用彩色編碼技術制作心臟顯影的彩色編碼圖像，采用紅色、橙色和白色依次代表心肌顯影的強度由弱到強。 8．統計分析：使用SPSS13．0統計分析軟件進行統計學分析，所有數據均以x±s表示。實驗一統計分析，采用o

12、ne-way ANOVA分析，方差不齊則選用近似F檢驗Welch法。組間多重比較方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊則采用Dunnet T3檢驗。實驗二組間比較采用二階段交叉設計方差分析，組內比較采用配對T檢驗。α=0．05為顯著性檢驗標準。 9．病理學及免疫組化檢查：圖像采集完成后，取出小鼠心臟，10％甲醛固定，行病理學檢查及免疫組化檢查。 結果： 1．超聲微泡制備情況：采用庫爾特技術儀測得庫爾特計數儀測得MBp濃

13、度為1．06×109個/ml，微泡平均粒徑為2．30±1．06μm；MBc濃度為1．03×109個/ml，微泡平均粒徑為2．07±1．13μm。 2．超聲微泡體外評價結果：采用綠色熒光標記的二抗與抗P-選擇素單抗結合，熒光顯微鏡下觀察顯示MBp外殼顯明顯綠色熒光，表明抗P-選擇素單抗與微泡外殼連接良好。 3．超聲微泡體內評價結果：攜熒光FITC的MB通過白細胞的介導實現和血管內皮的非特異性靶向，而MBp則可直接與血管內皮

14、結合實現特異性靶向，顯示了特異的粘附性能。TNF-α處理組MBp粘附數量多達12．0±2．6個/視野，MB僅為3．0±1．2個/視野，兩者相比具有顯著差異（P=0．002）；而對照組MBp和MB粘附數量分別為1．4±0．6個/視野和2．4±1．1個/視野，兩者之間未見顯著差異（P=0．472）。TNF-α處理組MBp粘附數量與對照組MBp和MB粘附數量相比差異顯著（P=0．002），并分別為對照組MBp和MB粘附數量的6．4±1．7倍和

15、9．9±2．1倍。 4．MCE檢查結果：MBp組的第一幀MCE圖像顯示缺血區(qū)域可見顯著造影增強，而非缺血區(qū)域無明顯超聲顯影；MB組第一幀MCE圖像缺血區(qū)域只見輕度造影增強，其顯影強度較MBp組缺血區(qū)域明顯減弱，非缺血區(qū)域未見明顯超聲顯影。 5．對比超聲Ⅵ分析：Ⅵ值在MBp組和MBc組非缺血區(qū)均未見顯著增大，分別為6．53±0．95和6．41±0．78，兩者之間無顯著性差異（P=0．522）；而在缺血區(qū)MBp組（25．98

16、±6．23）較MBc組（9．12±0．91）顯著增大，兩者之間差異具有顯著性（P=0．000）。MBp組缺血區(qū)Ⅵ值為非缺血區(qū)的4．03±1．08倍（P=0．000），而MBc組缺血區(qū)Ⅵ值僅為非缺血區(qū)的1．44±0．18倍（P=0．000）。 6．心肌病理及免疫組化檢查結果：HE染色切片顯示，非缺血區(qū)心肌組織可見心肌纖維結構正常，間質無充血水腫，缺血區(qū)心肌可見輕微心肌間質水腫、結締組織疏松，血管周圍可見少量淋巴細胞浸潤等早期炎癥性

17、改變。免疫組化結果示，缺血再灌注心肌組織非缺血部位血管內皮無明顯P-選擇素表達，而缺血區(qū)血管內皮P-選擇素表達明顯增加。 結論： 1．采用“抗生物素蛋白/生物素復合體”可實現抗P-選擇素單抗與脂質微泡外殼的有效連接而成功構建攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡； 2．普通微泡與靶組織的粘附主要是通過非特異的方式通過白細胞介導實現的；攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡則主要通過與靶組織血管內皮細胞P-選擇素直接特異性結合實現主動