眼鏡蛇毒磷脂酶A-,2-抑制低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡不依賴(lài)其酶活性.pdf

1、中樞神經(jīng)變性疾病指中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些區(qū)域的神經(jīng)元發(fā)生退行性變.退行性變與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān),在老年性癡呆和帕金森氏病等疾病中起關(guān)鍵作用,因此凋亡的機(jī)制是解開(kāi)這些老年病之謎的鑰匙,也是研制治療藥物的根據(jù).探討中樞神經(jīng)元凋亡機(jī)制需要一個(gè)可靠、有效、重復(fù)性高、易于操作的細(xì)胞模型.小腦顆粒神經(jīng)元(CGNs)在哺乳動(dòng)物腦中含量豐富.體外培養(yǎng)時(shí),高鉀(25mM KCl)培養(yǎng)基可維持其分化、成熟和存活,而去血清、低鉀(5mM KCl)培養(yǎng)基可誘導(dǎo)分化成

2、熟的CGNs凋亡.CGNs來(lái)源豐富,體外培養(yǎng)純度可達(dá)95％,已使用多年,技術(shù)成熟,結(jié)果可靠,所以此凋亡模型已成為研究神經(jīng)元的一個(gè)最常見(jiàn)的模型,被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)元凋亡機(jī)制的研究,以及防治與凋亡有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新藥開(kāi)發(fā)中.該實(shí)驗(yàn)室首次從眼鏡蛇毒中發(fā)現(xiàn),其中一個(gè)酸性蛋白成分200 ng/ml與CGNs孵育16h,可抑制低鉀引起的CGNs凋亡.此組分經(jīng)連續(xù)柱層析分離提純,用SDS-PAGE測(cè)出分子量為14 kDa,測(cè)N末端20位氨基酸序

3、列發(fā)現(xiàn)與眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>相同,鑒定為眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>,pHstat滴定法測(cè)定其磷脂酶A<,2>活性為15.0±0.5 Unit/mg.用蛋白免疫印跡法(western Blotting)研究其保護(hù)CGNs的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制發(fā)現(xiàn),其不通過(guò)ERKl/2、PI3K/Akt/FKHR、cAMP/PKA通路、鈣通道和α非敏感性N受體這幾條經(jīng)典的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)通路起作用.磷脂酶A<,2>可通過(guò)兩條途徑發(fā)揮生物學(xué)活性:水解重要

4、的磷脂,生成游離脂肪酸和溶血磷脂引起相應(yīng)的藥理效應(yīng),或通過(guò)與受體和結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合介導(dǎo)其他功能.那究竟眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>抑制低鉀引起的CGNs凋亡是通過(guò)其磷脂酶A<,2>活性的水解產(chǎn)物,還是通過(guò)與受體和結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合起作用?為回答此問(wèn)題,于是改良眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>分離純化方法,分析其保護(hù)作用的量效曲線;研究眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>在各腦區(qū)是否有特異性結(jié)合部位,對(duì)大腦皮層神經(jīng)元是否有保護(hù)作用;探討其他來(lái)源的磷脂酶A<,2>是否也有類(lèi)

5、似功能,分析它們保護(hù)作用的量效曲線;并進(jìn)一步研究這種保護(hù)作用和磷脂酶A<,2>酶活性的關(guān)系.結(jié)論:1.中華眼鏡蛇粗毒5g經(jīng)CM-Sephadex C-50、DEAE-Sephadex A-50和Sephadex G-75連續(xù)柱層析分離,得到50 mg能抑制低鉀引起的CGNs凋亡的純化磷脂酶A<,2>組分.2.眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>在1~400 ng/ml內(nèi)濃度依賴(lài)地抑制低鉀引起的CGNs凋亡.3.<'125>I標(biāo)記眼鏡蛇毒磷脂酶A<,

6、2>在大鼠腦內(nèi)的結(jié)合部位密度從高到低分別是:基底核、腦干、大腦皮層、中腦、白質(zhì)、小腦.4.100~800 ng/ml的眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>不能抑制秋水仙堿誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元凋亡.5.眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>保護(hù)CGNs作用和磷脂酶A2活性分離.因?yàn)榛瘜W(xué)修飾使眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>酶活性幾乎消失,而保護(hù)CGNs的能力保留;熱處理后的眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>酶活性保留,而保護(hù)CGNs的能力大幅度降低;多個(gè)蛇毒和蜂毒來(lái)源的磷脂酶A<,