磷脂酶A-,2-脫細(xì)胞方法制備組織工程角膜支架.pdf

1、目的:探索使用胰腺磷脂酶A2（PLA2）制備的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)作為組織工程角膜支架材料的可行性。 方法:在適宜的酶促反應(yīng)條件（pH8.3，1.8mMCa2+）下，使用200U/mlPLA2和0.5％脫氧膽酸鈉（Sodiumdeoxycholate，SD）處理正常豬角膜（Nativeporcinecornea，NPC）以制備脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)（Acellularporcinecornealstroma，APCS），并對制備的APCS

2、的物理學(xué)特點和生物學(xué)特性進(jìn)行了詳細(xì)評價。包括：體外條件下，檢測了APCS的脫細(xì)胞程度，膠原和蛋白多糖的結(jié)構(gòu)與含量的變化；檢測了APCS中殘留PLA2和SD的含量，及其浸提液對兔角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性的影響；評價了APCS的光學(xué)透明性和生物力學(xué)特性。體內(nèi)條件下，行新西蘭大白兔皮下移植實驗初步評價APCS的生物相容性和免疫原性后，通過新西蘭大白兔的板層角膜移植實驗，評價了APCS的整體功能：植片上皮化、免疫原性，透明性、

3、生物力學(xué)性質(zhì)、生物穩(wěn)定性和術(shù)后愈合情況；通過種植兔角膜上皮細(xì)胞，評價了使用APCS作為支架材料構(gòu)建組織工程化板層角膜的生物學(xué)特點。 結(jié)果:體外實驗證實：該脫細(xì)胞方法去除了NPC中91％的DNA成分，對羥脯氨酸成分未產(chǎn)生明顯影響，保留了80％的氨基葡聚糖成分；APCS中膠原纖維的超微結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化。APCS內(nèi)僅殘留0.35±0.04U/mgPLA2和4.3±0.8ng/mgSD，其浸提液不影響兔角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞

4、的增殖；300～800nm波長范圍內(nèi)，APCS的體外透光率與NPC無差異；在生理和病理眼壓范圍內(nèi)，APCS的生物力學(xué)特性與NPC無差異；體內(nèi)實驗證實：使用APCS行兔皮下移植實驗2周后，沒有觀察到中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；使用APCS行兔板層角膜移植術(shù)后，植片可在8±2天完全上皮化；84±11天恢復(fù)高度透明，此時APCS移植組透光率與正常角膜無差異；移植術(shù)后80天，APCS植片上可觀察到良好的上皮愈合、基質(zhì)愈合和明顯的神經(jīng)修復(fù)現(xiàn)象；

5、術(shù)后12個月的觀察期內(nèi)，未見明顯的植片新生血管、植片形變和植片降解現(xiàn)象。板層角膜構(gòu)建實驗證實：以APCS為支架材料種植兔角膜上皮細(xì)胞，1天即可形成完整的單層角膜上皮，7天可形成3～4層角膜上皮細(xì)胞復(fù)層結(jié)構(gòu)，12天時種植細(xì)胞與APCS之間存在明顯的半橋粒和基底膜，細(xì)胞連接相關(guān)蛋白Occludin、Desmocollin、Cadherin和β4均陽性表達(dá)。 結(jié)論:使用PLA2脫細(xì)胞方法有效的去除了幾乎所有的異種抗原成分，沒有造成膠原