聯(lián)合應(yīng)用ROCK2及GSK-3β抑制劑促進(jìn)新生大鼠皮層神經(jīng)元氧糖剝奪后突起再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxia ischemic encephalopathy，HIE）是由于圍生期窒息導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損害，是導(dǎo)致新生兒死亡及神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥如腦癱、智力障礙和癲癇的重要原因，但目前仍然缺乏有效的措施能夠改善因圍產(chǎn)期窒息所致的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞骨架降解在缺氧缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而細(xì)胞骨架又是介導(dǎo)神經(jīng)元軸突的發(fā)生、延長與再生的關(guān)鍵。神經(jīng)元細(xì)胞骨架的兩個(gè)重

2、要成分肌動(dòng)蛋白絲（f-actin）與微管（β-tubulin）分別受Rho/ROCK及AKT/GSK-3β信號(hào)通路的調(diào)控，因此，本研究將從神經(jīng)元細(xì)胞骨架的整體調(diào)控出發(fā)，以體外培養(yǎng)的SD大鼠皮層神經(jīng)元為研究對(duì)象，觀察氧糖剝奪（OGD）后，分別聯(lián)合應(yīng)用ROCK2抑制劑法舒地爾（Fasudil）、GSK-3β抑制劑（TDZD-8）以及兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的保護(hù)、神經(jīng)元突起再生及細(xì)胞凋亡的影響，為臨床上開發(fā)聯(lián)合用藥治療新生兒缺氧缺血性腦病

3、提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　取新生24h SD大鼠，按照Beaudoin的方法將皮層神經(jīng)元在體外培養(yǎng)至7d后，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組（不做任何處理），缺氧復(fù)氧組（OGD后單純復(fù)氧），F(xiàn)asudil組（OGD后復(fù)氧同時(shí)加入Fasudil），TDZD-8組（OGD后復(fù)氧同時(shí)加入TDZD-8），聯(lián)合用藥組（OGD后復(fù)氧同時(shí)加入Fasudil與TDZD-8）；參考Alluri的方法建立氧糖剝奪模型（oxygen and glu

4、cose deprivation，OGD），各組使用相應(yīng)藥物處理后，用細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒（CCK8）檢測細(xì)胞活性，原位末端標(biāo)記染色法（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡率，神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白β-3 tubulin免疫熒光標(biāo)記下測量神經(jīng)元突起長度，免疫熒光染色比較f-actin及β-tubulin表達(dá)情況，Western Blot檢測信號(hào)通路蛋白及細(xì)胞骨架蛋白R(shí)OCKII、p-GSK-3β、f-actin、β-tubulin的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以

5、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x?s)表示。數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析比較組間差異，P<0.05時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?、磐ㄟ^CCK-8法檢測各濃度梯度的細(xì)胞活性，確定了Fasudil和TDZD-8的最佳濃度分別是10μmol/L(1.37±0.08,P<0.05)和1μmol/L(1.36±0.08,P<0.05)，并將上訴藥物濃度用于進(jìn)一步研究。與正常對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧組的細(xì)胞活性

6、顯著降低(0.58±0.04,P<0.05)，進(jìn)行藥物干預(yù)后，F(xiàn)asudil組（1.37±0.09）和TDZD-8組（1.36±0.08）細(xì)胞活性明顯提高(P<0.05)；相比單獨(dú)用藥，聯(lián)合用藥組對(duì)細(xì)胞活性有更顯著地提高(1.67±0.06,P<0.05)。⑵正常對(duì)照組、缺氧復(fù)氧組、Fasudil組、TDZD-8組、聯(lián)合用藥組神經(jīng)元凋亡率分別是：7.20±1.76，68.34±4.15，40.11±2.74，39.43±2.98，30.

7、46±2.27；結(jié)果表明氧糖剝奪后細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.05），F(xiàn)asudil和TDZD-8具有一定神經(jīng)保護(hù)作用，可以減少細(xì)胞凋亡（P<0.05），而聯(lián)合用藥能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)一步降低細(xì)胞凋亡率（P<0.05）。⑶利用神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白β-3 tubulin進(jìn)行熒光染色，通過Image-Pro-Plus6.0（IPP）測量神經(jīng)元最長突起長度，進(jìn)行組間比較。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組(242.37±7.78)相比，缺氧復(fù)氧組神經(jīng)突起長度

8、明顯縮短(100.21±10.03,P<0.05)，而Fasudil組和TDZD-8組神經(jīng)突起長度均大于缺氧復(fù)氧組(174.14±5.91,170.79±9.17,P<0.05)，但小于聯(lián)合用藥組(207.00±9.71, P<0.05)，表明聯(lián)合用藥可以更好的保護(hù)神經(jīng)元形態(tài)，促進(jìn)突起再生。⑷為了觀察氧糖剝奪及Fasudil與TDZD-8對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的作用，我們通過對(duì)f-actin及β-tubulin進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)氧糖剝奪之后

9、，神經(jīng)元失去了正常的細(xì)胞形態(tài)，f-actin及β-tubulin的表達(dá)強(qiáng)度顯著降低，而Fasudil組和TDZD-8組均可以維持正常的神經(jīng)元的形態(tài)，f-actin及β-tubulin的表達(dá)強(qiáng)度均強(qiáng)于缺氧復(fù)氧組，但有所差別，F(xiàn)asudil組在f-actin上有更高的表達(dá)強(qiáng)度，而TDZD-8組在β-tubulin的表達(dá)上更顯著。聯(lián)合用藥組在f-actin及β-tubulin的表達(dá)上更加均衡，更接近于正常對(duì)照組。⑸氧糖剝奪后，ROCK2表達(dá)明

10、顯增加，p-GSK3β大幅下調(diào)，f-actin及β-tubulin的表達(dá)均明顯減少（P<0.05）；應(yīng)用Fasudil后，ROCK2表達(dá)顯著減少（P<0.05），p-GSK3β表達(dá)無明顯改變（P>0.05），f-actin及β-tubulin表達(dá)均明顯增加（P<0.05），但f-actin增加更為顯著（P<0.05）；而應(yīng)用TDZD-8后，p-GSK3β表達(dá)顯著增加（P<0.05），對(duì)ROCK2的表達(dá)無明顯影響（P>0.05），f-ac

11、tin及β-tubulin表達(dá)增多（P<0.05），以β-tubulin增加更為顯著（P<0.05）；與單獨(dú)用藥相比，聯(lián)合用藥在減少ROCK2表達(dá)及上調(diào)p-GSK3β活性上具有協(xié)同作用（P<0.05），f-actin及β-tubulin的表達(dá)均比單獨(dú)用藥明顯增加（P<0.05）。根據(jù)上面的結(jié)果，我們推ROCK2及p-GSK3β均參與了OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架崩解，F(xiàn)asudil可以通過調(diào)節(jié)ROCK2保護(hù)f–actin，而TDZD-8主要通過

12、抑制GSK3β保護(hù)β-tubulin，因此，聯(lián)合Fasudil和TDZD-8可以更好地保護(hù)細(xì)胞骨架的完整性。
　　結(jié)論：
　　氧糖剝奪之后，神經(jīng)細(xì)胞骨架被破壞，細(xì)胞骨架重要組成蛋白表達(dá)量減少，導(dǎo)致神經(jīng)元突起短縮，細(xì)胞凋亡增加。單獨(dú)應(yīng)用 Fasudil或 TDZD8后，可以在一定程度上維持細(xì)胞骨架形態(tài)，減少細(xì)胞骨架蛋白降解，促進(jìn)神經(jīng)元突起生長，減少細(xì)胞凋亡，但與正常神經(jīng)元相比，仍有一定差距；聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用，可以更好的保護(hù)