顳葉癲癇大鼠海馬GSK-3β的動(dòng)態(tài)變化及其抑制劑在苔蘚纖維出芽中的作用.pdf

1、第一部分GSK-3β在戊四氮慢性點(diǎn)燃大鼠海馬表達(dá)與活性的動(dòng)態(tài)變化
　　目的:在戊四氮慢性點(diǎn)燃大鼠過程中動(dòng)態(tài)觀察GSK-3β，P-GSK-3β(ser9)，P-tau(ser396)蛋白在海馬的表達(dá)變化，探討GSK-3β在苔蘚纖維出芽過程中的作用。
　　方法:6-8周健康雄性SD大鼠，共135只，將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=90)和對照組(n=45)。實(shí)驗(yàn)組予以每日腹腔注射戊四氮亞驚厥劑量(30mg/kg)建立慢性點(diǎn)燃顳葉癲癇模

2、型，對照組每日予以腹腔注射等量的生理鹽水。根據(jù)首次腹腔注射后第3天，1周，2周，4周和6周將實(shí)驗(yàn)組和對照組隨機(jī)分為5個(gè)亞組。每個(gè)亞組再分為三個(gè)小組，實(shí)驗(yàn)組每小組6只大鼠，對照組每小組3只大鼠，分別進(jìn)行:(1) Timm染色觀察海馬苔蘚纖維出芽并評分;(2)Western blot方法檢測GSK-3β，及其非活性形式P-GSK-3β(ser9)和下游磷酸化底物P-tau(ser396)三個(gè)指標(biāo)在海馬的總蛋白量的表達(dá)變化。(3)免疫組化方法

3、分別檢測GSK-3β、P-GSK-3β(ser9)、P-tau(ser396)在海馬各區(qū)域的表達(dá)及分布變化。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)驗(yàn)組大鼠模型點(diǎn)燃成功率為94.7％，死亡率2.1％，所有達(dá)到完全點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)的大鼠均可見到反復(fù)自發(fā)癇性發(fā)作。對照組大鼠行為正常，始終未見癇性發(fā)作。
　　2.對照組大鼠CA3區(qū)在各時(shí)間點(diǎn)均未見明顯出芽，實(shí)驗(yàn)組大鼠CA3區(qū)在點(diǎn)燃過程的第3天即觀察到少量苔蘚纖維出芽，并呈進(jìn)行性增加。與對照組相應(yīng)時(shí)間

4、點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組內(nèi)除4周組與6周組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P＞0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)之間比較均有差異(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠齒狀回內(nèi)分子層均未見到明顯的苔蘚纖維出芽，兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.Western blot結(jié)果顯示:在戊四氮慢性點(diǎn)燃大鼠過程中，GSK-3β表達(dá)成升高趨勢，2周時(shí)達(dá)高峰，6周時(shí)恢復(fù)至正常水平。其非活性形式P-GSK-3β(ser9)表達(dá)變化與之相反

5、，兩周時(shí)表達(dá)下調(diào)至低峰，6周時(shí)恢復(fù)至正常水平。除6周組外，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)與對照組相比具有差異(P＜0.05)。P-tau(ser396)呈升高趨勢，6周時(shí)達(dá)高峰，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)與對照組相比均有差異(P＜0.05)。組內(nèi)除2周組，4周組與6周組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P＞0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)之間比較均有差異(P＜0.05)。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示:GSK-3β，P-GSK-3β(ser9)，P-tau(ser396)的蛋白表達(dá)變

6、化趨勢與Western blot結(jié)果一致，但每個(gè)指標(biāo)在海馬各區(qū)的表達(dá)變化存在差異，實(shí)驗(yàn)組與對照組的三個(gè)指標(biāo)在CA3區(qū)的變化差異最大(P＜0.05)，DG區(qū)次之(P＜0.05)，CA1區(qū)無明顯變化趨勢(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.GSK-3β可能通過調(diào)節(jié)tau磷酸化水平參與苔蘚纖維出芽的過程。
　　2.GSK-3β在CA3區(qū)的表達(dá)及活性變化可能較DG區(qū)變化在顳葉癲癇形成過程中更為重要。
　　第二部分干預(yù)G

7、SK-3β對苔蘚纖維出芽及顳葉癲癇的形成與發(fā)展的影響
　　目的:探討在大鼠慢性點(diǎn)燃過程中干預(yù)GSK-3β活性對tau蛋白磷酸化水平及苔蘚纖維出芽的影響。
　　方法:6-8周清潔級健康雄性SD大鼠，共180只，將大鼠隨機(jī)分為PTZ+SB216763干預(yù)組(n=90)和PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組(n=90)。兩組大鼠均予以每日腹腔注射戊四氮亞驚厥劑量(30mg/kg)建立慢性點(diǎn)燃顳葉癲癇模型，同時(shí)分別在點(diǎn)燃過程的第2天，第4天，第6

8、天予以干預(yù)組大鼠側(cè)腦室注射GSK-3β的選擇性抑制劑SB216763，實(shí)驗(yàn)組大鼠予以側(cè)腦室注射空白對照DMSO溶劑（經(jīng)生理鹽水稀釋）。將每組大鼠劃分為3天，1周，2周，4周，6周5個(gè)亞組，每組18只大鼠，每個(gè)亞組再分為3各小組，每個(gè)小組6只大鼠，分別進(jìn)行:(1)Timm染色觀察兩組大鼠海馬苔蘚纖維出芽差異;(2)Western blot方法分別檢測兩組大鼠GSK-3β，P-GSK-3β(ser9)和P-tau(ser396)在海馬的總蛋

9、白量變化差異。(3)免疫組化方法進(jìn)一步檢測上述三個(gè)指標(biāo)在海馬各區(qū)域的表達(dá)及分布變化差異。
　　結(jié)果:1.干預(yù)組大鼠經(jīng)戊四氮亞驚厥劑量重復(fù)刺激出現(xiàn)癇性發(fā)作的時(shí)間（第8天）晚于實(shí)驗(yàn)組（第5天）。實(shí)驗(yàn)組大鼠平均點(diǎn)燃時(shí)間為21.4±1.8天，而干預(yù)組大鼠平均點(diǎn)燃時(shí)間為26.4±1.2天。干預(yù)組大鼠模型點(diǎn)燃成功率僅82.6％，而實(shí)驗(yàn)組成功率為91.4％。以上各差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。干預(yù)組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的死亡率分別為6.8％和7

10、.9％，無顯著差異(P＞0.05)。但與第一部分實(shí)驗(yàn)組的死亡率2.1％相比，均存在顯著差異(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組達(dá)完全點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)的大鼠均可觀察到反復(fù)Ⅱ-Ⅳ級的自發(fā)發(fā)作，而干預(yù)組大鼠僅有50％的大鼠可觀察到Ⅱ-Ⅲ級的自發(fā)發(fā)作，差異顯著(P＜0.01)。兩組大鼠均未觀察到V級自發(fā)發(fā)作或癲癇持續(xù)狀態(tài)。
　　2.實(shí)驗(yàn)組大鼠CA3區(qū)起始層在點(diǎn)燃過程的第3天就已出現(xiàn)輕度苔蘚纖維出芽，隨著給藥天數(shù)逐漸增加，苔蘚纖維出芽評分也逐漸升高。相比之下，

11、干預(yù)組CA3區(qū)起始層在點(diǎn)燃過程的第3天仍未見到出芽，1周時(shí)僅可見到少量點(diǎn)狀Timm染色顆粒，隨著給藥天數(shù)逐漸增加，苔蘚纖維出芽評分的增長趨勢也明顯減慢，與實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組大鼠而在齒狀回內(nèi)分子層區(qū)域，僅部分大鼠可見點(diǎn)狀Timm顆粒，兩組間相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.western blot及免疫組化結(jié)果均顯示GSK-3β的總表達(dá)量在兩組大鼠的表達(dá)變化趨勢一致，均在

12、3天時(shí)表達(dá)上調(diào)，2周時(shí)達(dá)高峰，4周時(shí)開始下降，除了4周干預(yù)組GSK-3β表達(dá)較實(shí)驗(yàn)組明顯下調(diào)外(P＜0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)組比均無顯著差異(P＞0.05)。
　　與實(shí)驗(yàn)組相比，干預(yù)組大鼠P-GSK-3β(ser9)的表達(dá)在3天組出現(xiàn)顯著升高(P＜0.01)，1周時(shí)表達(dá)開始緩慢下降，到2周時(shí)下降至最低值，4周時(shí)表達(dá)上調(diào)，6周時(shí)與實(shí)驗(yàn)組無顯著差異，除6周組外(P＞0.05)，兩組間各時(shí)間點(diǎn)比較仍存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

13、
　　P-tau(ser396)在兩組大鼠中的表達(dá)均呈升高趨勢，但干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)的P-tau(ser396)表達(dá)量均低于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，尤其是3天組的表達(dá)量甚至低于正常的大鼠，與實(shí)驗(yàn)組相比存在顯著差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.抑制GSK-3β的活性可延緩顳葉癲癇的形成與發(fā)展，減輕癇性發(fā)作程度。
　　2.抑制GSK-3β的活性可能通過降低tau蛋白磷酸化水平抑制苔蘚纖維出芽。
　　第三部

14、分干預(yù)GSK-3β對相關(guān)基因在顳葉癲癇大鼠海馬的表達(dá)影響
　　目的:觀察GSK-3β及其上游調(diào)節(jié)因子PTEN，AKT1和下游底物MAPT在戊四氮慢性點(diǎn)燃大鼠中的基因表達(dá)變化，探討GSK-3β信號通路在顳葉癲癇中的作用。
　　方法:6-8周健康雄性SD大鼠，共50只，將大鼠隨機(jī)分為PTZ+SB216763干預(yù)組(n=20)，PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組(n=20)和DMSO+SB216763對照組(n=10)。PTZ+SB21676

15、3干預(yù)組，PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組予以每日腹腔注射戊四氮亞驚厥劑量(30mg/kg)，DMSO+SB216763對照組每日腹腔注射等量生理鹽水，根據(jù)首次腹腔注射后第3天，1周，2周，4周和6周將三組大鼠隨機(jī)分為5個(gè)亞組。PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組，PTZ+SB216763干預(yù)組每個(gè)亞組4只大鼠，DMSO+SB216763對照組每個(gè)亞組2只大鼠。分別于點(diǎn)燃過程的第2天，第4天，第6天分別予以干預(yù)組及對照組大鼠側(cè)腦室注射GSK-3β的選擇性抑制劑

16、SB216763，實(shí)驗(yàn)組側(cè)腦室注射DMSO溶劑（經(jīng)生理鹽水稀釋）。采用RT-PCR方法按時(shí)間點(diǎn)檢測各組大鼠GSK-3β及其上游調(diào)節(jié)因子PTEN，AKT1和下游底物MAPT的基因表達(dá)變化。
　　結(jié)果:1.與DMSO+SB216763對照組相比，PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組大鼠GSK-3β從第3天開始即出現(xiàn)表達(dá)上升趨勢，1周時(shí)達(dá)高峰，4周時(shí)表達(dá)下調(diào)，6周時(shí)下降至正常水平，除6周組外(P＞0.05)，與DMSO+SB216763對照組各時(shí)間點(diǎn)

17、相比均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。PTZ+SB216763干預(yù)組與PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組大鼠相比，其表達(dá)變化趨勢一致，除4周組表達(dá)有所下調(diào)外(P＜0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)均無差異(P＞0.05)。
　　2.與DMSO+SB216763對照組相比，GSK-3β的上游負(fù)調(diào)控因子AKT1在PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組大鼠3天，1周，6周時(shí)表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，2周，4周時(shí)與對照組無差異(P＞0.05)。PTZ+SB216763干預(yù)組與

18、PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組大鼠表達(dá)趨勢基本一致，除6周的表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。其他各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均無顯著差異(P＞0.05)。
　　3.PTEN為GSK-3β上游正調(diào)控因子，PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組大鼠與DMSO+SB216763對照組大鼠相比，第3天即出現(xiàn)顯著升高趨勢，1周時(shí)上升達(dá)高峰，2周時(shí)表達(dá)下降，6周時(shí)表達(dá)低于對照組，除4周組外(P＞0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。PTZ+SB216763干預(yù)

19、組與PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組大鼠相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P＞0.05)。
　　4.GSK-3β的下游磷酸化底物總tau蛋白MAPT在PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組大鼠的表達(dá)與DMSO+SB216763對照組大鼠相比，第3天即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)行性上升，第4周時(shí)達(dá)高峰，第6周時(shí)下降至對照組水平。除6周組外(P＞0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。PTZ+SB216763干預(yù)組與PTZ+DMSO實(shí)驗(yàn)組大鼠相比，雖仍從