β-arrestin1-2在Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡的作用機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述。
　　第一部分β-arrestin1/2影響Aβ25-35的神經(jīng)毒性
　　一、寡聚Aβ25-35具有神經(jīng)毒性，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激繼而發(fā)生細(xì)胞凋亡。
　　1寡聚Aβ25-35顯著降低神經(jīng)源性細(xì)胞的存活率。
　　2寡聚Aβ25-35可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　3寡聚Aβ25-35誘導(dǎo)神經(jīng)源性細(xì)胞凋亡。
　　二、β-arrestins在

2、AD病人血樣及AD細(xì)胞模型中的表達(dá)異于正常對照組血樣及對照組細(xì)胞模型。
　　1 ARRB1和ARRB2在AD病人血樣中表達(dá)低于正常老年人對照組血樣。
　　2穩(wěn)定表達(dá)APP的HEK293(20E2)與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞相比，β-arrestinl和β-arrestin2蛋白水平顯著降低。
　　3外源性Aβ25-35處理的神經(jīng)細(xì)胞，β-arrestin1和β-arrestin2表達(dá)具有時間依賴性。
　　三

3、、ARRB1對Aβ的神經(jīng)毒性的影響異于ARRB2的影響。
　　1人源性神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y中，ARRB1干擾后，Aβ25-35處理SH-SY5Y細(xì)胞的存活率顯著降低，而干擾ARRB2的SH-SY5Y細(xì)胞在Aβ25-35處理后的存活率明顯升高。
　　2β-arrestin1對SH-SY5Y細(xì)胞增殖相關(guān)信號具有抑制作用。
　　第二部分β-arrestin1/2通過參與Aβ誘導(dǎo)自噬的形成及自噬泡的降解，影響Aβ的神經(jīng)毒性<

4、br>　　一、Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生自噬
　　1 Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬。
　　2.Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y的自噬為保護(hù)性自噬。
　　3.Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12的自噬為損傷性自噬。
　　4 SH-SY5Y細(xì)胞與PC12細(xì)胞基礎(chǔ)自噬水平不同。
　　二、β-arrestin1參與Aβ25-35誘導(dǎo)自噬的形成
　　1.AD細(xì)胞模型中β-arrestins表達(dá)水平與LC3B-Ⅱ/LC3B-

5、Ⅰ—致。
　　2.干擾ARRB1降低Aβ25-35相關(guān)的細(xì)胞自噬水平。
　　3.干擾ARRB2不影響Aβ25-35相關(guān)的細(xì)胞自噬水平。Western blotting結(jié)果示，干擾ARRB2后，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、beclin1、ATG7的基礎(chǔ)水平無明顯降低，加入Aβ25-351h后，干擾ARRB2的SH-SY5Y細(xì)胞的LC3B表達(dá)與對照組無明顯差異;該結(jié)果表明下調(diào)β-arrestin2不影響自噬泡的形成。
　　三、β

6、-arrestins不參與損傷溶酶體影響Aβ25-35神經(jīng)毒性。
　　1 Aβ25-35損傷細(xì)胞的溶酶體。用lysosomal tracker red染SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)中的溶酶體，共聚焦顯微鏡拍照結(jié)果示，陰性對照組細(xì)胞中，溶酶體被染成紅色點(diǎn)狀，均勻分布在胞質(zhì)中，Aβ25-35處理組，紅色點(diǎn)狀的溶酶體數(shù)量上減少，單個溶酶體染色變淺，且具有時間依賴性。該結(jié)果表明Aβ25-35抑制細(xì)胞內(nèi)溶酶體的正常功能。
　　2β-arres

7、tins不能通過影響細(xì)胞內(nèi)溶酶體緩解Aβ25-35毒性。lysosomal trackerred染色溶酶體，共聚焦顯微拍照結(jié)果示，無Aβ25-35處理組細(xì)胞，干擾ARRB1組細(xì)胞胞質(zhì)中紅色點(diǎn)狀的溶酶體與陰性組細(xì)胞質(zhì)中相比輕度減少，Aβ25-35處理組中，陰性干擾組與ARRB1干擾組的紅色點(diǎn)狀溶酶體數(shù)量上基本不變，單個溶酶體染色深淺無差異。
　　第三部分β-arrestins通過參與神經(jīng)元細(xì)胞膜表面的α7nAchR表達(dá)，影響Aβ25

8、-35的神經(jīng)毒性
　　一、α7nAchR對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　1.α7nAchR在AD病人血樣中的表達(dá)低于正常對照組血樣。我們通過實時定量PCR分析兩種樣本血樣中基因CHRNA7的轉(zhuǎn)錄水平差異，研究α7nAchR在正常老年人與AD病人的表達(dá)，結(jié)果示，在與正常老年人組比較，AD病人組樣本血樣中αCHRNA7的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。該結(jié)果表明病人血樣中，CHRNA7基因的轉(zhuǎn)錄水平受到抑制。
　　2.α7nAchR激動劑

9、尼古丁具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，干擾α7nAchR后會抑制細(xì)胞活性并顯著降低尼古丁的保護(hù)作用。細(xì)胞MTT實驗結(jié)果分析，提前加入尼古丁可以活化α7nAchR，部分逆轉(zhuǎn)Aβ25-35的神經(jīng)毒性，增加細(xì)胞的存活率。干擾α7nAchR不僅抑制細(xì)胞的增殖能力，而且增強(qiáng)Aβ25-35的神經(jīng)毒性，干擾α7nAchR后，尼古丁不能增加Aβ25-35處理組細(xì)胞的存活率。上述實驗結(jié)果表明，Aβ25-35存在時，α7nAchR，可以對細(xì)胞起保護(hù)作用，尼古丁可以通

10、過活化α7nAchR增強(qiáng)該保護(hù)作用。減少膜表面的α7nAchR，不但會使尼古丁保護(hù)作用失效，而且會增強(qiáng)Aβ25-35的神經(jīng)毒性。
　　二、下調(diào)β-arrestin2增強(qiáng)尼古丁對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　1.下調(diào)β-arrestin1對尼古丁的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用無影響。根據(jù)細(xì)胞MTT實驗結(jié)果，陰性干擾組中預(yù)先加入尼古丁可以降低Aβ25-35的細(xì)胞毒性，增加SH-SY5Y細(xì)胞的存活率，干擾ARRB1組SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)Aβ25-

11、35處理后，細(xì)胞死亡率增加，而尼古丁處理組與尼古丁非處理組相比，不能提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率。該結(jié)果說明下調(diào)β-arrestin1可以增加Aβ25-35的毒性，且不能通過尼古丁影響Aβ25-35的神經(jīng)毒性作用。
　　2.下調(diào)β-arrestin2增強(qiáng)尼古丁對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞MTT實驗結(jié)果分析，陰性干擾組中預(yù)先加入尼古丁可以降低Aβ25-35的細(xì)胞毒性，增加SH-SY5Y細(xì)胞的存活率，干擾ARRB2組細(xì)胞經(jīng)Aβ25-35處理后，

12、SH-SY5Y細(xì)胞死亡率與陰性干擾組細(xì)胞相比顯著減少，其中尼古丁處理組與尼古丁非處理組相比，神經(jīng)細(xì)胞的存活率顯著增加。該結(jié)果說明下調(diào)β-arrestin2可以通過增強(qiáng)尼古丁的神經(jīng)保護(hù)作用緩解Aβ25-35的毒性。
　　三、β-arrestin2參與細(xì)胞膜表面的α7nAchR表達(dá)
　　1.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，SH-SY5Y細(xì)胞在Aβ25-35處理后，存活的SH-SY5Y細(xì)胞膜表面的α7nAchR有輕度增加。該結(jié)果表明細(xì)胞膜表面

13、的α7nAchR的數(shù)量受外界因素影響出現(xiàn)變化，比如Aβ25-35。
　　2.下調(diào)β-arrestin1輕度升高基礎(chǔ)水平的α7nAchR。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析，與陰性干擾組相比，下調(diào)β-arrestin1可以輕度增加細(xì)胞膜表面的α7nAchR數(shù)量。該結(jié)果表明下調(diào)β-arrestin1可以輕度增加細(xì)胞膜表面的α7nAchR的數(shù)量。
　　3.干擾β-arrestin2顯著升高基礎(chǔ)水平的α7nAchR。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析，下調(diào)β-ar

14、restin2可以顯著增加細(xì)胞膜表面的α7nAchR數(shù)量。該結(jié)果表明單獨(dú)干擾β-arrestin2的表達(dá)可以顯著增加細(xì)胞膜表面α7nAchR的數(shù)量。
　　第四部分結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)
　　結(jié)論
　　1.β-arrestin1/2在正常老年人與同年齡段阿爾茲海默病病人體內(nèi)中表達(dá)具有差異，為研究AD發(fā)生發(fā)展及治療方法的切入靶點(diǎn)。
　　2.β-arrestin1低表達(dá)時增加Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)毒性，β-ar

15、restin2低表達(dá)時減緩Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)毒性。
　　3.β-arrestin1參與Aβ誘導(dǎo)的自噬。
　　4.β-arrestin2低表達(dá)通過上調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞膜表面α7nAchR表達(dá)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。
　　創(chuàng)新點(diǎn)與不足之處
　　1.首次報道β-arrestins在Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用。阿爾茲海默病進(jìn)展的主要原因之一就是神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，因此，尋找神經(jīng)元細(xì)胞死亡的影響基因，

16、并及時加以干預(yù)，緩解神經(jīng)元細(xì)胞的死亡是目前很有價值的治療方向之一。
　　2.首次報道β-arrestin1通過參與Aβ25-35誘導(dǎo)的自噬影響神經(jīng)細(xì)胞的存活。但β-arrestins如何參與自噬需要進(jìn)一步研究。
　　3.首次報道β-arrestins通過影響細(xì)胞膜表面α7nAchR表達(dá)影響神經(jīng)細(xì)胞存活。
　　α7nAchR數(shù)量及活性的降低使神經(jīng)細(xì)胞死亡增加，是阿爾茲海默病人出現(xiàn)認(rèn)知障礙及記憶力下降的主要原因之一，而且增