成年大鼠全腦嚴(yán)重缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡機(jī)制及3-甲基腺嘌呤的作用研究.pdf

1、目前，心腦血管病位居我國(guó)死亡原因的第一位。腦組織對(duì)缺血缺氧的敏感性高、耐受性低，損傷往往最為嚴(yán)重，且決定著患者的預(yù)后。有研究發(fā)現(xiàn)自噬參與腦缺血缺氧損傷，迄今，成年動(dòng)物全腦缺血復(fù)灌損傷中3-MA是否同樣具有腦保護(hù)作用尚不明確。
　　 研究目的：
　　 本研究旨在探討成年大鼠20 min全腦嚴(yán)重缺血誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡方式及其死亡機(jī)制，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索3-MA對(duì)全腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡的作用，并闡明其作用

2、機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.全腦缺血模型制作：采用四血管法制作成年大鼠全腦缺血模型，缺血20 min后恢復(fù)腦血流灌注。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組：①模型組（control）：全腦缺血20 min;②假手術(shù)組（sham）：除不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈外其他同模型組；③R60組：復(fù)灌后60min側(cè)腦室注射600nmol3-MA;④I30組：缺血前30 min側(cè)腦室注射600 nmol3-MA;⑤I60組：缺血前60min側(cè)

3、腦室注射600 nmol3-MA。
　　 3.HE染色：經(jīng)左心室灌注固定、取腦石蠟包埋、制作海馬冠狀切片、常規(guī)HE染色，光鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)每mm存活神經(jīng)元數(shù)量。
　　 4.免疫組化染色：海馬平面冠狀切片，依次經(jīng)過(guò)脫臘、熱修復(fù)抗原、H2O2孵育、封閉、cathepsin B或cleaved caspase-3一抗孵育、二抗孵育、3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色、復(fù)染、透明

4、、封片等步驟，光學(xué)顯微鏡下觀察。
　　 5.TUNEL染色：海馬切片，依次經(jīng)過(guò)脫蠟、水化、Proteinase K處理、TUNEL反應(yīng)混合液反應(yīng)、converter-POD反應(yīng)、DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片等，最后光學(xué)顯微鏡觀察。
　　 6.電鏡：海馬CA1和齒狀回（dentate gyrus，DG）組織依次經(jīng)過(guò)戊二醛固定、鋨酸固定、脫水、包埋、固化、超薄切片、3％醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改

5、變。
　　 7.Western blot:大鼠在缺血20min復(fù)灌不同時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，快速分離海馬，勻漿并離心后提取蛋白，蛋白定量后進(jìn)行Western blot檢測(cè)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.HE染色結(jié)果表明20min全腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡仍以海馬CA1區(qū)為主，呈現(xiàn)出遲發(fā)性死亡過(guò)程，復(fù)灌7天后CA1區(qū)95.2％神經(jīng)元死亡。
　　 2.復(fù)灌72小時(shí)（hour,h）后絕大部分CA1區(qū)變性神經(jīng)元TUNEL

6、染色陽(yáng)性，表明DNA有規(guī)律地?cái)嗔眩崾竞ｑRCA1區(qū)神經(jīng)元死亡為程序性死亡。
　　 3.電鏡下觀察到細(xì)胞器空泡變性、細(xì)胞膜、核膜溶解消失、核碎裂、膠質(zhì)細(xì)胞增生等形態(tài)學(xué)改變，符合壞死的形態(tài)學(xué)特征。同時(shí)可觀察到自噬小體和自噬溶酶體的形成，但未觀察到凋亡結(jié)構(gòu)，這些形態(tài)學(xué)改變符合程序性壞死。
　　 4.Western blot及免疫組化研究結(jié)果均提示全腦缺血20min復(fù)灌后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元無(wú)caspase-3表達(dá)的增加和激活，說(shuō)

7、明caspase-3依賴的凋亡不參與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元程序性壞死。
　　 5.Westem blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血20min復(fù)灌1-48hLC3-Ⅱ表達(dá)增加，提示復(fù)灌階段自噬激活。
　　 6.海馬組織中cathepsin B主要以活化形式儲(chǔ)存于溶酶體內(nèi)，全腦缺血復(fù)灌損傷時(shí)cathepsin B的表達(dá)和激活均未出現(xiàn)明顯改變。但復(fù)灌48 h后可見(jiàn)cathepsin B從溶酶體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，且與神經(jīng)元變性死亡密切相關(guān)

8、，說(shuō)明cathepsin B的釋放可能是神經(jīng)元死亡的決定性因素。
　　 7.缺血前側(cè)腦室注射600nmol3-MA能顯著抑制神經(jīng)元死亡，且具有時(shí)間依賴性，缺血前60 min較缺血前30 min給藥更為有效，而復(fù)灌后60 min注射3-MA無(wú)保護(hù)作用。
　　 8.TUNEL染色表明缺血前側(cè)腦室注射600 nmol3-MA能顯著減少TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量。
　　 9.缺血前、后側(cè)腦室注射600 nM3-MA對(duì)cat

9、hepsin B的表達(dá)以及激活均無(wú)影響，但缺血前側(cè)腦室注射600 nM3-MA能顯著抑制 cathepsin B的釋放。
　　 結(jié)論：
　　 1.成年大鼠全腦缺血20 min后海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元死亡主要是由溶酶體酶cathepsin B釋放所介導(dǎo)的一種程序性壞死。
　　 2.3-MA對(duì)缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元程序性壞死具有時(shí)間依賴性的保護(hù)作用，抑制cathepsin B的釋放可能是其主要的作用機(jī)制。
　　 3.