線粒體動(dòng)力學(xué)異常在異氟烷致發(fā)育期大鼠神經(jīng)元毒性中作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　據(jù)2006年報(bào)道,僅美國每年約有600萬嬰幼兒在全身麻醉(全麻)下接受手術(shù),其中嬰兒約150萬;盡管中國目前尚無相關(guān)數(shù)據(jù),但基于國內(nèi)的人口規(guī)模,每年接受全麻手術(shù)的嬰幼兒應(yīng)比美國多。由于人類神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育始于妊娠4-5w,而止于出生后若干年后;一般認(rèn)為人類大腦發(fā)育高峰期在妊娠后期至出生后6m。因此全麻是否對患兒智力發(fā)育及其長期認(rèn)知功能產(chǎn)生不良影響是近年來備受關(guān)注的熱點(diǎn)問題。
　　已有臨床研究表明,嬰幼兒時(shí)期,特別

2、是兩歲以內(nèi)的嬰兒接受全身麻醉會(huì)導(dǎo)致較長時(shí)期的行為改變,提示全麻藥可能損害嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)。近年來基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵期(嚙齒類動(dòng)物為出生前兩天到出生后1~2w),全麻藥(異氟烷、七氟烷、地氟烷、氯胺酮及異丙酚)影響動(dòng)物發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性,并導(dǎo)致發(fā)育期神經(jīng)元凋亡及其它退行性神經(jīng)病變,最后影響成年期動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能。
　　吸入麻醉藥在臨床麻醉中應(yīng)用非常廣泛。新近研究表明,吸入麻醉藥異氟烷致發(fā)育期神經(jīng)元內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡

3、,最終觸發(fā)線粒體途徑凋亡。但是吸入麻醉藥影響線粒體結(jié)構(gòu)和功能的確切機(jī)制尚不清楚。如果小兒全麻不可避免,那么闡明吸入麻醉藥導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常的準(zhǔn)確機(jī)制,并探索有效的防治手段,是亟待解決的難題之一。
　　線粒體是一個(gè)不斷進(jìn)行分裂、融合等動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器,這種動(dòng)態(tài)變化稱為線粒體動(dòng)力學(xué)。線粒體分裂/融合主要受一下兩組蛋白的調(diào)控:(1)調(diào)節(jié)線粒體分裂的drp-1(dynamin-relatedprotein)、mff(mitochon

4、drialfissionfactor)、FIS1;(2)調(diào)節(jié)線粒體融合的mfn(mitofusion1)1、mfn2、OPA1(opticatrophy1)。生理狀況下,線粒體分裂/融合既決定線粒體形狀和大小,也調(diào)節(jié)線粒體的分布和功能,對維持細(xì)胞生理功能發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元內(nèi)線粒體分裂/融合異常影響神經(jīng)突生長、突觸形成、長時(shí)程增強(qiáng),甚至神經(jīng)元凋亡等。
　　調(diào)節(jié)線粒體分裂、融合的蛋白參與了很多神經(jīng)退行性疾病過程中神經(jīng)元

5、凋亡和突觸聯(lián)系障礙等病理變化。在凋亡早期,哺乳動(dòng)物細(xì)胞中drp-1活性增加,促進(jìn)線粒體碎片化和分裂,增加線粒體膜的通透性,促使細(xì)胞色素C(cytochromeC,cyto-C)釋放,最終觸發(fā)線粒體途徑凋亡。在阿爾茨海默病和亨廷頓舞蹈癥等研究中發(fā)現(xiàn),β淀粉樣蛋白(Aβ)、亨廷頓蛋白(huntingtin,HTT)及帕金蛋白(Parkin)都可促使神經(jīng)元內(nèi)drp-1表達(dá)上調(diào)且與drp-1相互作用,激活drp-1,促進(jìn)線粒體過度分裂甚至碎片化

6、,進(jìn)而導(dǎo)致線粒體動(dòng)力學(xué)異常,甚至神經(jīng)元凋亡并損害突觸聯(lián)系的建立,最終導(dǎo)致患者長期認(rèn)知功能障礙。由此可見,線粒體異常分裂是凋亡的早期表現(xiàn);神經(jīng)元線粒體分裂、融合失衡是退行性神經(jīng)病變的病理生理基礎(chǔ)。
　　神經(jīng)元胞漿Ca2+可通過多種信號通路調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)蛋白活性,繼而調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué),影響神經(jīng)元存活及其他功能。在傷害性刺激下,神經(jīng)元胞漿Ca2+濃度([Ca2+]c)持續(xù)升高,繼而激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN),

7、引起drp-1第637絲氨酸去磷酸化,導(dǎo)致drp-1活性增強(qiáng)并向線粒體移位,促進(jìn)線粒體分裂,進(jìn)而引起線粒體片段化甚至神經(jīng)元凋亡,最終干擾突觸聯(lián)系及神經(jīng)環(huán)路形成。本項(xiàng)目組的前期研究證實(shí),臨床相關(guān)濃度的異氟烷可致神經(jīng)元[Ca2+]c升高。但是,異氟烷是否通過這條信號通路,引起線粒體分裂/融合失衡并最終導(dǎo)致發(fā)育期神經(jīng)元毒性有待于進(jìn)一步研究。
　　因此本研究擬從離體細(xì)胞和在體動(dòng)物水平,根據(jù)異氟烷作用后,線粒體形態(tài)及線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)

8、的變化,選擇對線粒動(dòng)力學(xué)起重要作用的調(diào)節(jié)蛋白,闡述線粒體動(dòng)力學(xué)失調(diào)在異氟烷抑制發(fā)育期神經(jīng)元毒性作用中的機(jī)制。
　　研究方法與結(jié)果：
　　1.異氟烷對發(fā)育期神經(jīng)元線粒體形態(tài)學(xué)和膜電位的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d(DIV5)海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為對照組(C組)以及異氟烷組(I組)。C組在5％CO2-8%O2-87%N2三氣培養(yǎng)箱中處理6h;I組以5%CO2-8%O2-87%N2作為載體氣,1.5%異氟烷處理6h,采用電鏡觀

9、察線粒體形態(tài)學(xué)的變化。DIV3海馬神經(jīng)元,轉(zhuǎn)染CellLight?Mitochondria-RFPBacMan2.0,異氟烷處理后在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體的形態(tài)學(xué)改變
　　結(jié)果:與C組比較,I組線粒體直接明顯減小(P<0.05)。在轉(zhuǎn)染了CellLight?Mitochondria-RFPBacMan2.0的神經(jīng)元中,與C組比較,I組神經(jīng)元變圓變小。
　　2.異氟烷對發(fā)育期神經(jīng)元線粒體膜電位的影響
　　方法:體外

10、培養(yǎng)第5d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為對照組(C組)以及異氟烷組(I組),處理同上。1.5%異氟烷處理6h。選用JC-1染色后在激光共聚焦顯微鏡和細(xì)胞流式儀下觀察線粒體膜電位變化。
　　結(jié)果:與C組標(biāo)膠,I組神經(jīng)元線粒體膜電位明顯去極化(P<0.05)。
　　3.異氟烷對發(fā)育期神經(jīng)元內(nèi)線粒體分裂/融合調(diào)節(jié)蛋白mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為對照組(C組)以及異氟烷組(I組),處理同上。

11、異氟烷結(jié)束后,提取總RNA和總蛋白,分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR和WesternBlot(WB)方法檢測線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)蛋白的mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化
　　結(jié)果:與C組相比,I組線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)蛋白在mRNA和蛋白水平的表達(dá)差異均無顯著性(P>0.05)。
　　4.異氟烷對發(fā)育期神經(jīng)元p-drp-1表達(dá)的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為對照組(C組)以及異氟烷組(I組),處理同上。異氟烷麻醉結(jié)束后提取總

12、蛋白,采用WB方法檢測drp-1第637絲氨酸磷酸化的表達(dá)(p-drp-1(ser637))。選用免疫熒光雙標(biāo)檢測p-drp-1(ser637)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:與C組比較,I組p-drp-1(ser637)表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。
　　5.抑制drp-1對異氟烷誘發(fā)發(fā)育期神經(jīng)元線粒體膜電位去極化的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為對照組(C組)、異氟烷組(I組)、mdivi-1預(yù)給藥后異氟

13、烷處理組(M+I組)及mdivi-1處理組(M組)。M+I組和M組在異氟烷處理2h前在無血清培養(yǎng)基中加入5μMmdivi-1,而后C組和M組載體氣處理6h,I組和M+I組1.5%異氟烷處理6h。異氟烷處理結(jié)束后,進(jìn)行JC-1染色,在激光共聚焦顯微鏡和細(xì)胞流式儀下檢測線粒體膜電位。
　　結(jié)果:與C組比較,M+I組和M組線粒體膜電位沒有明顯變化(P>0.05),I組線粒體膜電位明顯去極化(P<0.05);與I組比較,M+I組和M組線粒

14、體膜電位水平較高(P<0.05)。
　　6.Mdivi-1對異氟烷誘發(fā)發(fā)育期神經(jīng)元線粒體形態(tài)學(xué)的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為C組、I組、M+I組、M組,處理同上。異氟烷處理結(jié)束后,采用電鏡觀察線粒體形態(tài)學(xué)的變化,采像后的圖片在Imaris下進(jìn)行處理統(tǒng)計(jì)。采用CellLight?Mitochondria-RFPBacMan2.0在海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)3d時(shí)轉(zhuǎn)染,在異氟烷處理結(jié)束后,固定、封片后在激光共聚焦顯

15、微鏡下觀察線粒體形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果:與C組比較,M組及M+I組線粒體直徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);I組線粒體直徑減小(P<0.05);線粒體密度增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與I組比較,M+I組線粒體直徑增大(P<0.05);線粒體密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　7.Mdivi-1對異氟烷誘發(fā)發(fā)育期神經(jīng)元存活率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為C組

16、、I組、M+I組、M組,處理同上。采用WB檢測細(xì)胞色素C(cytochromeC,cyto-C)的表達(dá);采用免疫熒光雙標(biāo)檢測activecaspase3染色陽性細(xì)胞數(shù)目。
　　結(jié)果:與C組比較,M組所檢測指標(biāo)差異無顯著性(P>0.05);I組AC3(activecaspase3)和cyto-C蛋白表達(dá)上調(diào),AC3陽性神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.05)。與I組比較,M+I組cyto-C蛋白表達(dá)降低,AC3陽性神經(jīng)元數(shù)目減少(P<0.05

17、)。
　　8.異氟烷對鈣神經(jīng)磷酸酶的表達(dá)和活性的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為對照組(C組)以及異氟烷組(I組),處理同上。采用試劑盒檢測CaN活性;提取總蛋白,用WB方法檢測CN表達(dá)。
　　結(jié)果:與C組比較,CaN表達(dá)明顯上調(diào),活性明顯增強(qiáng)(P<0.05)。
　　9.CaN抑制劑FK506對異氟烷誘導(dǎo)的p-drp-1表達(dá)和線粒體形態(tài)學(xué)改變的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)

18、分為對照組(C組)、異氟烷組(I組)、FK506預(yù)給藥后異氟烷處理組(F+I組)及FK506處理組(F組)。F+I組和F組在異氟烷處理2h前在無血清培養(yǎng)基中加入5μMFK506,而后C組合F組載體氣處理6h,I組和F+I組1.5%異氟烷處理6h。異氟烷處理結(jié)束后,WB檢測p-drp-1的表達(dá)。采用CellLight?Mitochondria-RFPBacMan2.0在海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)3d時(shí)轉(zhuǎn)染,在異氟烷處理結(jié)束后,固定、封片后在激光共

19、聚焦顯微鏡下觀察線粒體形態(tài)學(xué)改變,采像后的圖片在Imaris下進(jìn)行處理統(tǒng)計(jì)。
　　結(jié)果:與C組比較,F組及F+I組所檢測指標(biāo)差異無顯著性(P>0.05);I組p-drp-1表達(dá)降低,線粒體直徑減小(P<0.05)。與I組比較,F+I組p-drp-1表達(dá)升高,線粒體直徑增加(P<0.05)。
　　10.FK506對異氟烷誘導(dǎo)的發(fā)育期神經(jīng)元凋亡的影響
　　方法:體外培養(yǎng)第5d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為C組、I組、F+I組、F組,

20、處理同上。采用WB檢測cyto-C的表達(dá);采用免疫熒光雙標(biāo)檢測AC3的表達(dá)。
　　結(jié)果:與C組相比,F組及F+I組所檢測指標(biāo)差異無顯著性(P>0.05);I組cyto-C蛋白表達(dá)上調(diào),AC3陽性神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.05)。與I組相比,F+I組cyto-C蛋白表達(dá)降低,AC3陽性神經(jīng)元數(shù)目減少(P<0.05)。
　　11.異氟烷對新生5d(postnatal5day,PND5)大鼠海馬線粒體形態(tài)學(xué)的影響
　　方法:P

21、ND5大鼠,隨進(jìn)分為C組合I組。C組吸入30%O2-70%N26h,I組以30%O2-70%N2作為載氣1.5%異氟烷處理6h,然后電鏡灌注液灌注后,取標(biāo)本放入2.5%戊二醛固定后,進(jìn)行電鏡檢測。
　　結(jié)果:與C組相比,I組海馬線粒體直徑減小(P<0.05),甚至有部分線粒體破裂。
　　12.異氟烷對PND5大鼠海馬線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)蛋白及p-drp-1表達(dá)的影響
　　方法:PND大鼠1.5%異氟烷處理6h后,取海馬組織

22、,提取總蛋白和總RNA,采用WB和實(shí)時(shí)定量PCR檢測線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)蛋白及p-drp-1的表達(dá)
　　結(jié)果:與C組相比,I組海馬線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)在mRNA和蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但是p-drp-1表達(dá)明顯降低(P<0.05)。
　　13.Mdivi-1對異氟烷誘導(dǎo)的PND5大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響
　　方法:PND大鼠隨機(jī)分為四組:C組、I組、M+I組及M組。C組和I組處理同前;M+I組在麻醉

23、2h前腹腔注射5μg/kgmdivi-1,然后1.5%異氟烷處理6h;M組腹腔注射5μg/kgmdivi-1然后吸入30%O2-70%N2。麻醉結(jié)束后,盡取海馬組織,提取總蛋白和總RNA,采用WB和實(shí)時(shí)定量PCR檢測cyto-C的表達(dá)。1.5%異氟烷處理6h后,4%多聚甲醛固定,取大腦切片,采用免疫熒光雙標(biāo)檢測AC3陽性神經(jīng)元數(shù)目。
　　結(jié)果:與C組相比,M+I組和M組所檢測指標(biāo)無明顯差異(P>0.05);I組cyto-C蛋白表達(dá)

24、上調(diào),AC3陽性神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.05)。與I組相比,M+I組cyto-C表達(dá)降低,AC3陽性神經(jīng)元數(shù)目減少(P<0.05)。
　　14.Mdivi-1對異氟烷誘導(dǎo)的PND5大鼠長期認(rèn)知障礙的影響
　　方法:PND大鼠1.5%異氟烷處理6h后,待其完全清醒,送回原籠飼養(yǎng)至60d,進(jìn)行水迷宮檢實(shí)驗(yàn)檢測其空間學(xué)習(xí)記憶功能。實(shí)驗(yàn)完成后,麻醉電鏡固定液灌注固定后,取海馬組織進(jìn)行電鏡檢測線粒體形態(tài)的變化。
　　結(jié)果:與C組

25、比較,I組第3~5天時(shí)逃避潛伏期延長,探索時(shí)間縮短(P<0.05),M+I組和M組逃避潛伏期和探索時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與I組比較,M+I組第3~5d時(shí)逃避潛伏期縮短,探索時(shí)間延長(P<0.05)。電鏡檢測發(fā)現(xiàn),與C組比較,I組線粒體直徑減少(P<0.05),M+I組和M組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與I相比,M+I組線粒體直徑增加(P<0.05)。
　　15.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS20統(tǒng)計(jì)軟件對

26、數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s),組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);Morris水迷宮大鼠訓(xùn)練期間數(shù)據(jù)采用連續(xù)測量的方差分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究總結(jié)：
　　一、主要研究結(jié)果
　　1.通過體外原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)以及在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明臨床相關(guān)濃度的異氟烷導(dǎo)致發(fā)育神經(jīng)元線粒體動(dòng)力學(xué)失衡。
　　2.體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),異氟烷激活發(fā)育期神經(jīng)元CaN,導(dǎo)致drp-1

27、第637位絲氨酸去磷酸化,繼而促使drp-1活性增加并向線粒體移位,導(dǎo)致線粒體過度分裂甚至碎片化,從而觸發(fā)線粒體途徑凋亡。
　　3.體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),drp-1抑制劑mdivi-1可減輕異氟烷發(fā)育期神經(jīng)元凋亡,改善異氟烷所致長期認(rèn)知功能障礙。
　　二、研究結(jié)論
　　異氟烷引起胞漿Ca2+濃度升高,激活CaN,促進(jìn)drp-1(ser637)去磷酸化,引起drp-1活性增強(qiáng)并向線粒體移位,從而導(dǎo)致線粒體過度分裂甚至碎片化