腦內(nèi)CaMKⅡ磷酸化在異氟烷吸入麻醉及神經(jīng)毒性中的作用.pdf

1、背景：
　　近30年來，吸入麻醉藥因其同時兼具全麻效應，對心、腦、腎等重要臟器的缺血損傷的保護作用及可能的神經(jīng)毒性，而成為麻醉領域的研究熱點之一，也引起了臨床的廣泛關注。為什么一種藥物會產(chǎn)生如此復雜的效應呢？其機制又是什么呢？目前尚不完全清楚。已有大量分子、細胞水平的離體和在體研究提示許多離子通道、離子通道型受體、經(jīng)典神經(jīng)遞質等可能是全麻中樞分子靶點。但它們是如何介導和終止其麻醉效應的，即其胞內(nèi)信號轉導分子及調(diào)控環(huán)節(jié)，尚知之甚少。

2、關于吸入麻醉藥的神經(jīng)毒性問題，目前證據(jù)也主要來源于動物實驗研究，其機制亦僅限于少量關于細胞凋亡方面的實驗研究。
　　鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是腦內(nèi)含量最豐富的蛋白激酶之一。CaMKⅡ能調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸的許多功能，如神經(jīng)遞質釋放、離子通道生理學和鈣離子的動態(tài)平衡。在控制神經(jīng)元的突觸強度和可塑性方面發(fā)揮重要的作用，與學習和記憶的形成等密切相關。顯然，CaMKⅡ的這些功能都與麻醉和睡眠覺醒密切相關，但是否參與麻醉效應的調(diào)

3、控尚無直接證據(jù)。新近研究表明，CaMKⅡ在心臟缺血保護、Glutamate/GABA介導的腦缺血損傷保護及神經(jīng)退行性病變中具有重要作用，使其成為相關領域新的藥物靶點之一。
　　近年來，我們研究發(fā)現(xiàn)，吸入麻醉-蘇醒過程中全麻敏感腦區(qū)內(nèi)CaMKⅡ等多種蛋白激酶分子發(fā)生顯著可逆性的磷酸化改變。這種現(xiàn)象引起了我們濃厚的興趣，結合已有研究我們推測，CaMKⅡ磷酸化可能參與吸入麻醉藥全麻效應及可能的神經(jīng)毒性作用的調(diào)控。因此，本研究擬探討CaM

4、KⅡ磷酸化對異氟烷全麻效應及神經(jīng)毒性的影響，以進一步探索吸入麻醉藥全麻效應及神經(jīng)毒性機制，為吸入麻醉藥的臨床安全合理應用提供科學的依據(jù)。
　　實驗一CaMKⅡ磷酸化對大鼠異氟烷全麻效應的影響
　　目的：
　　探討CaMKⅡ磷酸化在異氟烷吸入全身麻醉中的作用。
　　方法：
　　采用經(jīng)側腦室置管全腦給藥，將SD大鼠隨機分為溶劑對照組(control組)、CaMKⅡ抑制劑鈣調(diào)蛋白自變性抑制肽(myrAIP1,5,

5、10uM)處理組(n=10)和CaMKⅡ激動劑鈣調(diào)素(CaM1.25,5,10ug)處理組(n=10)，給藥40min后行異氟烷吸入麻醉(1MAC，30min),觀察給藥后動物的行為反應變化，記錄大鼠異氟烷麻醉及清醒時翻正反射(LORR)消失及恢復時間，并于異氟烷麻醉30min取腦組織樣本進行pCaMKⅡα蛋白定量分析。
　　結果：
　　給予CaMKⅡ抑制劑組的動物LORR恢復時間有明顯延長(P<0.05)，激動劑組動物LO

6、RR消失及恢復時間有明顯縮短(P<0.05)；與對照組相比，抑制劑組全腦內(nèi)pCaMKⅡα蛋白表達量在給藥40min時間點和異氟烷麻醉30min時間點均明顯降低(P<0.05)，皮層內(nèi)pCaMKⅡα蛋白表達量在異氟烷麻醉30min時間點明顯下降(P<0.05)。
　　結論：
　　異氟烷麻醉-蘇醒過程中大鼠腦內(nèi)CaMKⅡ磷酸化水平呈可逆性抑制改變，調(diào)控腦內(nèi)CaMKⅡ磷酸化水平可部分改變異氟烷麻醉-蘇醒的過程。
　　實驗二異

7、氟烷暴露對原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用研究
　　目的：
　　探討異氟烷暴露對原代培養(yǎng)大鼠腦皮質神經(jīng)元細胞的毒性作用。
　　方法：
　　選用懷孕16-18天的孕鼠，取其胎鼠皮層神經(jīng)元進行體外培養(yǎng)，取培養(yǎng)7～10天的神經(jīng)元進行實驗。隨機分為四組(n=10)：溶劑對照組(CON)、異氟烷溶液0.32mM處理組(0.32)、0.64mM處理組(0.64)和0.96mM處理組(0.96)。各組均處理6h，檢測各組細胞活

8、力MTT和乳酸脫氫酶的釋放LDH，并進行TUNEL凋亡細胞染色和計數(shù)。
　　結果：
　　與對照組相比，三種濃度異氟烷處理組的MTT值均顯著降低(P<0.05)，LDH釋放百分比則明顯升高(P<0.05)，TUNEL陽性細胞亦明顯增多(P<0.05)，但不同劑量組之間均無差異(P>0.05)。
　　結論：
　　異氟烷暴露可誘導胎鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元凋亡增加而產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應。
　　實驗三CaMKⅡ磷酸化在異氟烷神

9、經(jīng)毒性中作用的體外實驗研究
　　目的：
　　探討CaMKⅡ磷酸化在異氟烷神經(jīng)毒性中的作用。
　　方法：
　　選取0.64mM異氟烷處理培養(yǎng)7～10天后的神經(jīng)細胞6h，異氟烷處理前提前兩天在培養(yǎng)基中加入CaMKⅡ抑制劑十四烷酰肉豆蔻酰-鈣調(diào)蛋白自變性抑制肽(myrAIP)或激動劑鈣調(diào)素(CaM),抑制劑實驗將細胞隨機分為對照組、異氟烷處理組、異氟烷加CaMKⅡ抑制劑組(濃度為1μM、5μM、10μM)(n=10)，

10、激動劑實驗分為對照組、異氟烷處理組、異氟烷加CaMKⅡ激動劑組(濃度為1.25μg、5μg、10μg)(n=10)。檢測細胞活力MTT和乳酸脫氫酶的釋放LDH，對細胞進行TUNEL熒光染色觀察凋亡細胞并計數(shù)。
　　結果：
　　抑制劑實驗中，與對照組相比，各處理組MTT值明顯降低、LDH釋放明顯增高(P<0.05)，凋亡神經(jīng)元明顯增多(P<0.05)，異氟烷加抑制劑組的凋亡細胞明顯多于單純異氟烷處理組(P<0.05)；激動劑實

11、驗中，異氟烷加激動劑組部分逆轉了單純異氟烷處理引起的MTT下降和LDH增高(P<0.05)并減輕了單純異氟烷處理引起的凋亡細胞增多(P<0.05)。
　　結論：
　　CaMKⅡ抑制劑能明顯加重異氟烷的神經(jīng)毒性，CaMKⅡ激動劑部分逆轉了了異氟烷的神經(jīng)毒性；抑制CaMKⅡ磷酸化導致凋亡增加可能是異氟烷神經(jīng)毒性的機制之一。
　　小結：
　　1.CaMKⅡ磷酸化水平的改變可在一定程度上對全身麻醉及蘇醒的進程產(chǎn)生影響，提