5-HT及其受體在異氟烷麻醉—覺(jué)醒調(diào)節(jié)中的作用及機(jī)制.pdf

1、自1846年乙醚被成功應(yīng)用于手術(shù)麻醉起，才真正誕生了現(xiàn)代意義上的手術(shù)外科學(xué)。在其后的100多年間，多種新型麻醉藥物相繼問(wèn)世。時(shí)至今日,全球每年有近2億人接受不同類型的手術(shù)治療，其中的絕大多數(shù)都需要接受麻醉，麻醉的使用范圍越來(lái)越廣。然而，全麻藥物是如何發(fā)揮麻醉效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)可逆性意識(shí)消失(Loss of Consciousness，LOC)的，卻一直未得到合理解釋。這一問(wèn)題已成為外科麻醉界和神經(jīng)科學(xué)界一個(gè)倍受關(guān)注的研究課題。2005年Scie

2、nce雜志更是將“How do general anesthetics work?”列入了當(dāng)今人類亟待解決的125個(gè)重要科學(xué)問(wèn)題之一。
　　已有研究證實(shí)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是大腦中，存在多個(gè)與全麻機(jī)制相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，包括被廣泛認(rèn)為促麻醉和睡眠的GABA能系統(tǒng)和促麻醉覺(jué)醒的orexin能系統(tǒng)，然而這兩個(gè)系統(tǒng)是如何相互作用的至今仍不清楚。5-羥色胺（5-HT）是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，存在于胃腸道嗜鉻細(xì)胞、血小板和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在中

3、樞由5-HT能神經(jīng)元合成。以往實(shí)驗(yàn)已證明5-HT在生理睡眠與覺(jué)醒中發(fā)揮重要作用，但是對(duì)5-HT究竟是促睡眠還是促覺(jué)醒，目前還沒(méi)有一致結(jié)論，我們分析可能和5-HT不同亞型的受體作用有關(guān)，但是目前這方面還沒(méi)有系統(tǒng)的研究。另外，5-HT在麻醉-覺(jué)醒機(jī)制中的作用尚未被研究，本實(shí)驗(yàn)試圖通過(guò)對(duì)5-HT及其受體的研究，觀察其在全身麻醉特別是蘇醒過(guò)程中的作用，并初步探索其作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)1
　　目的：通過(guò)側(cè)腦室注射的方法觀察5-HT及其

4、受體在異氟烷麻醉-覺(jué)醒調(diào)控中的作用。
　　方法：雄性SD大鼠（體重250-280g），按隨機(jī)分組法分為14組（I-XIV，n=6）。在2％戊巴比妥40-60mg/kg腹腔麻醉下，將微注射套管埋置于側(cè)腦室，并在顱骨表面固定。大鼠在術(shù)后休息5天后隔天進(jìn)行一次異氟烷麻醉-覺(jué)醒實(shí)驗(yàn)。將大鼠置入翻轉(zhuǎn)麻醉箱并給予1.5%的異氟烷麻醉,記錄麻醉誘導(dǎo)時(shí)間（翻正反射消失時(shí)間）。麻醉誘導(dǎo)成功后第15min，同一組大鼠前后三次實(shí)驗(yàn)分別隨機(jī)給予5μL s

5、aline或兩種不同劑量的同一種5-HT/受體激動(dòng)劑或拮抗劑（具體給藥試劑及劑量見(jiàn)表2），泵注時(shí)間5min。麻醉30min后（即給藥結(jié)束10 min后）停止異氟烷吸入，觀察大鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間，即異氟烷的麻醉覺(jué)醒時(shí)間。
　　結(jié)果: I組動(dòng)物側(cè)腦室注射0.5umol5-HT后異氟烷麻醉的覺(jué)醒時(shí)間縮短（P<0.05），II組動(dòng)物側(cè)腦室注射20μg5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT后異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間顯著縮短（P<0.01），II

6、I組動(dòng)物側(cè)腦室注射50μg5-HT1A受體拮抗劑WAY100635后，異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間延長(zhǎng)（P<0.001）。VI組動(dòng)物側(cè)腦室注射5μg5-HT2A/C受體激動(dòng)劑DOI后麻醉覺(jué)醒時(shí)間也縮短（P<0.05），VIII組動(dòng)物側(cè)腦室注射25μg5-HT2C受體拮抗劑RS102221后麻醉覺(jué)醒延遲（P<0.05），其余組動(dòng)物側(cè)腦室給予5-HT1B、2A、3A、6、7型受體激動(dòng)劑和拮抗劑后對(duì)異氟烷麻醉覺(jué)醒無(wú)明顯影響（P>0.05）。
　　

7、實(shí)驗(yàn)2
　　目的：通過(guò)Pef區(qū)微注射5-HT1A受體激動(dòng)劑和拮抗劑研究其在異氟烷麻醉-覺(jué)醒調(diào)控中的作用和機(jī)制。
　　方法：
　　2.1觀察Pef區(qū)注射5-HT1A受體激動(dòng)劑/拮抗劑對(duì)異氟烷麻醉大鼠誘導(dǎo)和覺(jué)醒時(shí)間的影響：SD大鼠（250-280g）隨機(jī)分為I、II兩組（n=6），先在Pef區(qū)放置微注射套管。5天后每組各進(jìn)行三次異氟烷麻醉覺(jué)醒實(shí)驗(yàn)，異氟烷吸入開(kāi)始后先觀察誘導(dǎo)時(shí)間，大鼠翻正反射消失時(shí)間為誘導(dǎo)時(shí)間。而后，在麻醉

8、15 min后I組動(dòng)物側(cè)腦室隨機(jī)注射0.3μLsaline、0.6或1.2μg5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT，II組動(dòng)物側(cè)腦室隨機(jī)注射0.3ul saline、1.5或3.0μg5-HT1A受體拮抗劑WAY10635，觀察覺(jué)醒時(shí)間，翻正反射恢復(fù)時(shí)間為覺(jué)醒時(shí)間。
　　2.2Pef區(qū)注射5-HT1A受體激動(dòng)劑/拮抗劑對(duì)異氟烷麻醉大鼠腦電的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機(jī)分為 I-III三組（n=6），先進(jìn)行腦電監(jiān)測(cè)電

9、極及 Pef核團(tuán)微注射套管埋置術(shù)，5天后進(jìn)行腦電觀察實(shí)驗(yàn)。將電極接入腦電檢測(cè)儀，記錄10min清醒狀態(tài)腦電波后，將大鼠放入0.75MAC異氟烷的翻轉(zhuǎn)箱40min后，I組Pef注射5μL saline，II組注射5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT1.2μg，III組注射5-HT1A受體拮抗劑WAY1006353.0μg，繼續(xù)記錄腦電波30min，比較給藥前后10min期間腦電圖的變化。2.3Pef區(qū)注射5-HT1A受體激動(dòng)劑/拮抗劑

10、對(duì)異氟烷麻醉大鼠神經(jīng)元Fos表達(dá)的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機(jī)分為I-IV四組（n=6），實(shí)驗(yàn)前在Pef核團(tuán)行微注射套管埋置術(shù)，5天后I組大鼠心腔注射10%KCL處死后多聚甲醛灌注取腦。II、III、IV接受1.5%異氟烷麻醉第15min后Pef分別注射0.3ul saline、1.2μg5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OHDPAT和3.0μg5-HT1A受體拮抗劑WAY100635，麻醉第30min甲醛灌注取腦。所有腦塊切片后進(jìn)

11、行 orexin和c-Fos免疫熒光雙標(biāo)染色，以觀察 Pef區(qū)域Orexin神經(jīng)元的活化狀態(tài)。
　　2.4Pef區(qū)注射5-HT1A受體激動(dòng)劑/拮抗劑對(duì)異氟烷麻醉大鼠血中orexin水平的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機(jī)分為I-III三組（n=6）,先行Pef核團(tuán)微注射套管埋置術(shù)，5天后進(jìn)行放射免疫實(shí)驗(yàn)。大鼠用1.5%異氟烷進(jìn)行麻醉，仰臥固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，將微注射管置入套管中。麻醉第15min三組分別泵入0.3μL sali

12、ne、1.2μg8-OH-DPAT和3.0μgWAY100635。于翻正反射消失時(shí)、麻醉第30min各從股靜脈抽取2ml靜脈血。提取血清后進(jìn)行放射免疫實(shí)驗(yàn)，測(cè)血清中orexin含量。
　　結(jié)果:Pef給予1.2μg5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT使異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P<0.001）,而給予1.5μg和3.0μg5-HT1A受體拮抗劑WAY100635均使麻醉覺(jué)醒時(shí)間縮短（P<0.05，P<0.001）。1.2μg

13、8-OH-DPAT可使腦電波的δ波明顯減少，出現(xiàn)暴發(fā)性抑制，并使 Pef區(qū)域 c-FOS陽(yáng)性 orexin神經(jīng)元數(shù)目比鹽水組明顯減少（P<0.05），外周靜脈血中Orexin含量降低（P<0.05），3.0μg WAY100635對(duì)0.75MAC異氟烷麻醉狀態(tài)下的大鼠的腦電波沒(méi)有明顯影響，但是可以使 c-Fos陽(yáng)性的 Orexin神經(jīng)元數(shù)目增多（P<0.05）、外周血Orexin含量升高（P<0.05），產(chǎn)生與8-OH-DPAT相反的作

14、用。
　　實(shí)驗(yàn)3
　　目的：探索VLPO區(qū)注射5-HT1A受體激動(dòng)劑/拮抗劑對(duì)異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　　3.1VLPO區(qū)注射5-HT1A受體激動(dòng)劑/拮抗劑對(duì)異氟烷麻醉大鼠覺(jué)醒時(shí)間的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機(jī)分為I、II兩組（n=6），實(shí)驗(yàn)前先在VLPO區(qū)埋置微注射套管。5天后每組各進(jìn)行三次異氟烷麻醉覺(jué)醒實(shí)驗(yàn)。從異氟烷吸入開(kāi)始，觀察動(dòng)物的麻醉誘導(dǎo)時(shí)間。大鼠翻正反射消失時(shí)間為誘

15、導(dǎo)時(shí)間。麻醉后15 min后I組動(dòng)物VLPO區(qū)注射0.3μLsaline、0.6或1.2μg5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT，II組動(dòng)物VLPO區(qū)注射0.3μLsaline、1.5或3.0μg5-HT1A受體拮抗劑WAY10635，觀察大鼠的覺(jué)醒時(shí)間。翻正反射恢復(fù)時(shí)間為覺(jué)醒時(shí)間。
　　3.2VLPO區(qū)注射5-HT1A受體激動(dòng)劑/拮抗劑對(duì)異氟烷麻醉大鼠腦電的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機(jī)分為I、II、III三組（n

16、=6），腦電監(jiān)測(cè)電極及VLPO核團(tuán)微注射套管埋置術(shù)，5天后進(jìn)行腦電觀察實(shí)驗(yàn)。將電極接入腦電檢測(cè)儀，記錄10min清醒狀態(tài)腦電波，將大鼠放入0.75MAC異氟烷的翻轉(zhuǎn)箱40min。隨后5min內(nèi)，I組Pef注射5μLsaline，II組注射5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT1.2μg，III組注射5-HT1A受體拮抗劑WAY1006353.0μg，繼續(xù)記錄腦電波30min，比較給藥前后10min腦電波變化記錄給藥前后腦電圖變化。

17、r>　　3.3VLPO區(qū)注射5-HT1A受體激動(dòng)劑/拮抗劑對(duì)異氟烷麻醉大鼠GABA神經(jīng)元Fos表達(dá)的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機(jī)分為I-IV四組（n=6），實(shí)驗(yàn)前在VLPO核團(tuán)行微注射套管埋置術(shù)，5天后I組大鼠心腔注射10%KCL處死后多聚甲醛灌注取腦。II、III、IV接受1.5%異氟烷麻醉第15 min后VLPO分別注射0.3μL saline、1.2μg5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OHDPAT和3.0μg5-HT1A受體

18、拮抗劑WAY100635,麻醉第30min甲醛灌注取腦。所有腦塊切片后進(jìn)行GABA和c-Fos免疫熒光雙標(biāo)染色，以觀察VLPO區(qū)域GABA神經(jīng)元的活化狀態(tài)。
　　結(jié)果：VLPO區(qū)注射1.2μg5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT后，異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間明顯縮短（P<0.05），而注射3.0μg其拮抗劑WAY100635使麻醉覺(jué)醒時(shí)間延長(zhǎng)（P<0.05）。另外，8-OH-DPAT可以使0.75MAC異氟烷麻醉下的大鼠腦電波的δ波明

19、顯減少，出現(xiàn)類覺(jué)醒波，甚至發(fā)生覺(jué)醒的行為學(xué)表現(xiàn)。3.0μg WAY100635對(duì)大鼠腦電波形沒(méi)有明顯影響。免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果尚未完成。
　　小結(jié)：本研究中我們通過(guò)三個(gè)步驟的實(shí)驗(yàn)，首先證明了側(cè)腦室注射5-HT的總體效應(yīng)是促進(jìn)異氟烷麻醉大鼠的覺(jué)醒，并證明其作用可能是通過(guò)其1A和2C受體產(chǎn)生的；其次，和我們預(yù)想的結(jié)果相反，我們發(fā)現(xiàn)Pef區(qū)orexin神經(jīng)元的5-HT1A受體興奮，反而抑制了麻醉覺(jué)醒；最后，我們證明5-HT可以通過(guò)5-HT1