ATP誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元神經(jīng)毒性及對GAP-43表達(dá)的影響.pdf

1、目的：三磷酸腺苷（ATP）是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，可以選擇性地作用于P2嘌呤受體，參與遞質(zhì)調(diào)節(jié)、突觸修飾和神經(jīng)營養(yǎng)等一系列生理作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)急慢性損傷（如缺血，創(chuàng)傷或退行性病等）條件下，局部死亡細(xì)胞可釋放出大量ATP，從而過度興奮P2嘌呤受體導(dǎo)致神經(jīng)毒性如神經(jīng)元死亡及小膠質(zhì)激活等一系列病理反應(yīng)，其中P2X7受體是介導(dǎo)ATP毒性作用的主要受體，過度激活該受體可導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排、胞膜出泡、細(xì)胞裂解等細(xì)胞凋亡及壞死現(xiàn)象。ATP對海馬神經(jīng)元是否

2、具有損傷作用，能否促進(jìn)損傷后突起的再生，是否與P2X7受體激活有關(guān)，目前還缺乏實(shí)驗(yàn)研究。生長相關(guān)蛋白（Growth associated protein43，GAP-43）是80年代初發(fā)現(xiàn)的與神經(jīng)發(fā)育、軸突再生和突觸重建密切相關(guān)的一種快速轉(zhuǎn)運(yùn)胞膜磷酸蛋白。本實(shí)驗(yàn)以GAP-43作為神經(jīng)損傷再生指標(biāo)，通過體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，觀察ATP及P2X7受體激動(dòng)劑BzATP對成熟期海馬神經(jīng)元損傷作用以及對GAP-43表達(dá)的影響，并檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平

3、的動(dòng)態(tài)變化，從而探討ATP對海馬神經(jīng)元損傷后再生的相關(guān)機(jī)制。 方法：對體外培養(yǎng)8d的原代大鼠海馬神經(jīng)元給予不同濃度的ATP干預(yù)，采用MTT法檢測細(xì)胞存活率；尼氏染色法觀察ATP及BzATP對神經(jīng)元的損傷情況，并觀察P2受體拮抗劑（pyridoxalphosphate-6-azophenyl-20，40-disulphonic acid，PPADS）以及P2X7受體拮抗劑（Brilliant blue G，BBG）對ATP所致的神

4、經(jīng)元是否有保護(hù)作用；應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測ATP、BzATP、PPADS和BBG等對GAP-43表達(dá)的影響；利用鈣熒光染料Flou-4/AM檢測上述干預(yù)劑對細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平影響，進(jìn)一步觀察ATP對GAP-43表達(dá)的影響是否與細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平改變有關(guān)。 結(jié)果： 一、與正常對照組相比，ATP低濃度組（100μM）對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元沒有明顯細(xì)胞毒性，MTT檢測示OD值為0．278±0．039，P>0．05，存活率為94

5、．2%；而ATP高濃度組（3mM、5mM和10mM）具有明顯的細(xì)胞毒性，OD值分別為0．202±0．043，0．194±0．018，0．159±0．016，P<0．05，存活率分別為68．5%，65．8%，53．9%；相差顯微鏡及尼氏染色示ATP高濃度組細(xì)胞胞體腫脹、突起斷裂、尼氏體脫失，提示ATP高濃度組對海馬神經(jīng)元具有明顯的神經(jīng)毒作用。加入P2受體拮抗劑PPADS后，細(xì)胞腫脹減輕，突起伸長，碎片減少。BzATP對海馬神經(jīng)元沒有明顯的

6、毒性作用，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹較輕，沒有明顯的突起斷裂及細(xì)胞死亡現(xiàn)象，而P2X7受體拮抗劑BBG沒有出現(xiàn)細(xì)胞腫脹減輕，突起伸長等ATP毒性阻斷現(xiàn)象。 二、ATP低濃度組（100μM）的GAP-43表達(dá)水平與正常對照組無顯著差異，而ATP高濃度組（5mM，10mM）的GAP-43的表達(dá)水平顯著增高，主要表達(dá)于胞體，突起減弱甚至消失，P<0．01；PPADS可促進(jìn)突起GAP-43的表達(dá)，突起數(shù)目與ATP10mM組相比顯著增多，P<0．05

7、，說明PPADS對ATP造成的神經(jīng)損傷具有一定的保護(hù)作用；BBG干預(yù)后GAP-43呈高表達(dá)，但與對照組比較，突起數(shù)沒有明顯增加。 三、采用Fluo-4/AM檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，通過計(jì)算熒光衰減率得出，5mMATP組和BzATP組熒光衰減速率減慢，分別為對照組94．9%，91．8%，P<0．05，有顯著性差異。PPADS處理組的衰減速率比5mMATP組顯著增快，P<0．05。BBG處理組的衰減速率較5mMATP組沒有顯著差異。

8、 結(jié)論： 一、低濃度ATP對海馬神經(jīng)元無損傷效應(yīng)；高濃度ATP對海馬神經(jīng)元具有明顯的細(xì)胞毒性。 二、高濃度ATP可促進(jìn)海馬神經(jīng)元胞體GAP-43的表達(dá)，提示有一定的損傷后代償修復(fù)作用；P2受體拮抗劑PPADS可抑制神經(jīng)元損傷，促進(jìn)損傷后突起生成及延伸，具有一定神經(jīng)保護(hù)作用。 三、P2X7受體激動(dòng)劑BzATP未造成海馬神經(jīng)元的明顯損傷，P2X7受體拮抗劑BBG沒有表現(xiàn)抑制ATP損傷及促進(jìn)損傷后突起的生成及延伸