干擾Hes1基因?qū)撬杌|(zhì)細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化前期的影響.pdf

1、第一部分 目的：本部分研究旨在通過對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)，觀察其生物學(xué)特性，了解其增殖分化和體外培養(yǎng)獲得大量擴(kuò)增的條件，為進(jìn)一步研究骨髓基質(zhì)細(xì)胞的定向分化奠定基礎(chǔ)。在體外環(huán)境下干擾骨髓基質(zhì)細(xì)胞中Hes1基因的表達(dá)，檢測Mash1基因的變化情況，探討骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下Hes1對Mash1的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)獲得骨髓基質(zhì)細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)分析在干擾H

2、es1基因表達(dá)的情況下Mash1基因表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：經(jīng)體外全骨髓分離培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，細(xì)胞均一性好，呈旋渦狀聚集，幾乎都表達(dá)CD71。應(yīng)用200nM，100nM，50nM，25nM 四種不同濃度梯度的siRNA干擾抑制Hes1基因，與對照組相比Hes1表達(dá)均降低。200nM 干擾后Hes1基因降低的程度是原來的0.036(P<0.05)，50nM 干擾后Hes1基因降低的程度是原來的0.076(P<0.05)，優(yōu)于

3、其他濃度的干擾效果。Hes1降低可使Mash1基因表達(dá)增加，且Hes1降低越顯著，Mash1表達(dá)增加越高。
　　 結(jié)論：干擾Hes1基因?qū)ash1基因的表達(dá)有影響，且呈負(fù)相關(guān)調(diào)控關(guān)系。
　　 第二部分 目的：通過檢測體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元過程中干擾Hes1基因?qū)ept-9，Stmn1基因的表達(dá)變化的分析，探討影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的機(jī)制。
　　 方法：取體外培養(yǎng)的第三

4、代的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，接種于多聚賴氨酸包被過的6孔培養(yǎng)板中，通過在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)因子RA、SHH和bFGF，誘導(dǎo)其向膽堿能神經(jīng)元分化。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)分析骨髓基質(zhì)細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的過程中干擾Hes1基因?qū)ept-9，Stmn1基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：Hes1經(jīng)單純誘導(dǎo)后表達(dá)增高；在干擾后誘導(dǎo)組中Hes1表達(dá)顯著增高。用50nM的siRNA 干擾Hes1后Sept-9基因表達(dá)增高；單純誘導(dǎo)分化P3的BMSC

5、s后Sept-9基因表達(dá)情況與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而干擾Hes1后誘導(dǎo)P3的BMSCs后Sept-9基因表達(dá)增高，且增高最顯著。用50nM的siRNA 干擾Hes1后Stmn1基因表達(dá)顯著增高；單純誘導(dǎo)分化P3的BMSCs后Stmn1基因表達(dá)稍有增高；而干擾Hes1后誘導(dǎo)P3的BMSCs后Stmn1基因表達(dá)顯增高，且其增高幅度介于干擾組與單純誘導(dǎo)組之間。
　　 結(jié)論：Hes1表達(dá)的高低影響發(fā)育相關(guān)基因Sept-9，Stmn1