脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元過程中干擾Hes1的表達(dá)對(duì)關(guān)鍵基因的影響.pdf

1、第一部分 目的：本部分的研究通過檢測(cè)胚胎大鼠脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞在RNA 干擾Hes1基因后定向誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元過程中對(duì)Mash1基因的影響，探討神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的分化機(jī)制。
　　 方法：將孕齡17 d的胚胎大鼠脊髓組織制備成單細(xì)胞懸液，接種到限定性無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待原代克隆球形成后單純誘導(dǎo)組加入誘導(dǎo)因子RA、SHH、NT-3和BDNF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化；干擾組加入干擾因子siRNA 6小時(shí)之后，再加

2、入同上的誘導(dǎo)因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析神經(jīng)干細(xì)胞在向膽堿能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化1w、2 w和干擾Hes1基因后誘導(dǎo)分化1w、2w時(shí)Mash1基因的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：Hes1、Mash1和ChAT mRNA在神經(jīng)干細(xì)胞整個(gè)培養(yǎng)過程中均有表達(dá)，Hes1和Mash1在誘導(dǎo)1w時(shí)各基因均較對(duì)照組表達(dá)下降，誘導(dǎo)2 w時(shí)表達(dá)較誘導(dǎo)1w時(shí)增高，但低于對(duì)照組；ChAT在整個(gè)誘導(dǎo)過程中呈增高趨勢(shì)。在進(jìn)行RNAi后，H

3、es1基因表達(dá)降低，Mash1基因表達(dá)誘導(dǎo)1w時(shí)較對(duì)照組低，誘導(dǎo)2w時(shí)又較誘導(dǎo)1w時(shí)高，且高于對(duì)照組和單純誘導(dǎo)組。在干擾Hes1基因并誘導(dǎo)分化后ChAT基因表達(dá)量均較對(duì)照組表達(dá)高，且較單純誘導(dǎo)組也高。
　　 結(jié)論：Hes1和Mash1參與了神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元的分化過程，并且發(fā)揮了重要的作用，Hes1對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中有調(diào)控作用，與Mash1呈負(fù)調(diào)控作用。Hes1表達(dá)的減弱和Mash1表達(dá)的增加可能是神經(jīng)干細(xì)胞由增殖轉(zhuǎn)向

4、神經(jīng)元分化的重要因素。
　　 第二部分 目的：在胚胎大鼠脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元過程中通過人為干擾Hes1基因的表達(dá)，檢測(cè)Aldoc、Stmn1、Ywhag和Sept-9基因的表達(dá)，探討神經(jīng)干細(xì)胞在誘導(dǎo)分化過程中Aldoc、Stmn1、Ywhag和Sept-9 可能發(fā)揮的作用及與Hes1基因的作用關(guān)系。
　　 方法：取體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，接種于多聚賴氨酸包被過的6孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入Hes1干擾因子

5、siRNA，然后在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)因子RA、SHH、NT-3和BDNF，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)分析神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化1w和2 w時(shí)以及siRNA 干擾Hes1基因并誘導(dǎo)分化1w和2w時(shí)Aldoc、Stmn1、Ywhag和Sept-9基因的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：在神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元的過程中，Aldoc基因表達(dá)量誘導(dǎo)后較對(duì)照組低；Stmn1和Ywhag基因表達(dá)量在誘導(dǎo)

6、1w時(shí)較對(duì)照組低，誘導(dǎo)2w時(shí)較誘導(dǎo)1w時(shí)高，且高于對(duì)照組；Sept-9基因表達(dá)量在誘導(dǎo)分化后較對(duì)照組呈降低趨勢(shì)，但誘導(dǎo)2w時(shí)又較誘導(dǎo)1w時(shí)高。在對(duì)Hes1基因干擾并將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元過程中，Aldoc基因表達(dá)量與對(duì)照組相比呈降低趨勢(shì)，但誘導(dǎo)2w時(shí)其表達(dá)量高于誘導(dǎo)1w時(shí)，且均高于單純誘導(dǎo)組表達(dá)量；Stmn1基因表達(dá)量在誘導(dǎo)1w和誘導(dǎo)2w時(shí)均較對(duì)照組高，且高于單純誘導(dǎo)組表達(dá)量；Ywhag基因表達(dá)量在誘導(dǎo)1w時(shí)較對(duì)照組低，誘導(dǎo)

7、2w時(shí)又比誘導(dǎo)1w時(shí)高，且低于單純誘導(dǎo)組；Sept-9基因表達(dá)量在誘導(dǎo)1w和誘導(dǎo)2w時(shí)均較對(duì)照組低，且均低于單純誘導(dǎo)組表達(dá)量。
　　 結(jié)論：Aldoc、Stmn1、Ywhag、Sept-9 參與了神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元的分化過程，Aldoc和Sept-9 可能對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的干性維持有一定作用；Stmn1和Ywhag 可能在脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元的后期發(fā)揮作用；并且Aldoc和Sept-9與Hes1呈正相關(guān)，St