神經(jīng)干細(xì)胞體外定向分化為多巴胺能神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在探討神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)分離培養(yǎng)和擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究抗壞血酸(ascorbic acid，AA)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)對(duì)體外培養(yǎng)的NSCs定向分化為多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的影響，為DA能神經(jīng)元的定向分化研究提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)從新生24h內(nèi)的SD

2、大鼠腦組織分離NSCs，采用無血清懸浮培養(yǎng)法進(jìn)行NSCs體外擴(kuò)增培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，通過繪制細(xì)胞生長曲線觀察NSCs的自我更新和增殖能力，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)NSCs標(biāo)志物神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein，Nestin)的表達(dá)及分化后細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron special enolase，NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary a

3、cidic protein，GFAP)和2，3-環(huán)核甘酸磷酸二脂酶(cyclic nucleotide phosphohydrolase，CNP)的表達(dá)；(2)第二代NSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別給予不同濃度的AA，10ng/mlGDNF及100 μmol/1 AA+10ng/ml GDNF。10d后終止誘導(dǎo)，進(jìn)行DA能神經(jīng)元特異性標(biāo)記物酪氨酸羥化酶(tyros ine hydroxylase，TH)和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(dopamine tra

4、nsporter，DAT)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)和TH基因的RT-PCR檢測(cè)。 結(jié)果：(1)從新生SD大鼠腦組織分離的細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中形成懸浮的神經(jīng)球。神經(jīng)球具有自我更新和表達(dá)Nestin的能力，分化后的細(xì)胞能表達(dá)神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原。(2)與對(duì)照組比較，不同濃度的AA組、10ng/ml GDNF組及100 μmol/1 AA+10ng/ml GDNF聯(lián)合誘導(dǎo)組均能增加NSCs向TH陽性細(xì)胞分化的比率

5、(p<0.05)。與單獨(dú)運(yùn)用100 μmol/1 AA或10ng/ml GDNF組比較，100 μmol/1AA+10ng/ml GDNF聯(lián)合誘導(dǎo)組可明顯提高NSCs向TH陽性細(xì)胞分化的比率(p<0.05)。各誘導(dǎo)組均檢測(cè)到TH mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：(1)從新生大鼠的腦組織中成功分離出NSCs，其具有在體外自我更新和增殖、多向分化潛能及表達(dá)Nestin的能力。(2)在本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度AA組均能促進(jìn)NSCs向DA能神經(jīng)元分化