Aβ1-42對(duì)大鼠膽堿能神經(jīng)元NOX2的影響及二氮嗪干預(yù)研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知功能下降為臨床特征神經(jīng)退行性疾病，是導(dǎo)致老年人癡呆最常見的原因，然而目前尚沒(méi)有令人滿意的治療措施。目前我國(guó)AD患者的數(shù)量隨著老齡化的加劇在迅速增長(zhǎng)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，因此對(duì)AD的研究具有重要的意義。
　　老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及選擇性神經(jīng)細(xì)胞凋亡是AD特征性的病理改變，而SP形成與β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-

2、protein，Aβ)的沉積有關(guān)。研究證實(shí)Aβ具有神經(jīng)毒性，可使細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)增加，使胞膜脂質(zhì)和蛋白被氧化修飾，導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)、細(xì)胞代謝紊亂，而后者又可加重ROS的生成，加劇氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激普遍存在于各種神經(jīng)變性疾病中，也是AD的重要病理機(jī)制之一，然而目前臨床上針對(duì)AD的抗氧化治療并未產(chǎn)生令人滿意的效果，對(duì)AD氧化應(yīng)激機(jī)制的深入研究將有助于尋找新的治療AD的靶點(diǎn)。
　　

3、由于線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈可產(chǎn)生ROS，既往一直認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源是線粒體，然而近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)顯示，NADPH氧化酶(NADPHoxidase，NOX)在細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生中同樣起重要作用。NOX是由細(xì)胞內(nèi)一組具有氧化活性的蛋白組成的酶復(fù)合體，其主要的生物學(xué)功能是產(chǎn)生ROS，分布于幾乎所有的器官、組織和細(xì)胞。NOX的亞基包括催化亞基gp91phox，調(diào)節(jié)亞基p22phox、p47phox，以及p67phox、p40phox、

4、Rac等，其中g(shù)p91phox和p22phox存在于胞膜，其他亞基分布于胞漿。而gp91 phox(NOX2)及其同源物NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2被稱為NOX家族。NOX通過(guò)生成的ROS參與細(xì)胞生理活動(dòng)的調(diào)控，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡以及細(xì)胞骨架重塑等，但在異常狀態(tài)下如缺血缺氧、機(jī)械損傷、毒性物質(zhì)或炎性因子刺激等過(guò)度激活可產(chǎn)生大量ROS，可造成氧化應(yīng)激損傷。NOX的激活需要各種亞基組裝成有活性的復(fù)合體

5、后才能發(fā)揮其生物學(xué)功能，而胞漿亞基向胞膜遷移并組裝成復(fù)合體是NOX激活的基礎(chǔ)，其中p47phox C末端的PRR區(qū)可以與p67phoxC末端的SH3區(qū)結(jié)合，從而發(fā)揮募集p67phox、p40phox和Rac的作用。研究顯示NOX參與了AD的病理過(guò)程，尤其是NOX2。幾種AD的動(dòng)物模型研究顯示阻斷NOX2具有神經(jīng)保護(hù)作用。在野生型小鼠大腦皮質(zhì)，利用Aβ1-40新皮層灌流可導(dǎo)致ROS生成及腦血管調(diào)節(jié)紊亂，而Aβ1-40處理的NOX2-/-小

6、鼠未出現(xiàn)ROS升高。將表達(dá)APP Swedish突變(Tg2576，可導(dǎo)致Aβ片段聚集)的小鼠與Cybb-/-鼠(NOX2功能缺失)雜交，發(fā)現(xiàn)去除功能性NOX2可抵抗Aβ斑塊的毒性作用，明顯降低氧化應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的神經(jīng)元和小鼠海馬中，基因沉默p47phox或利用二苯基碘(Diphenylene iodonium，DPI)阻斷NOX2可抑制經(jīng)NMDA受體誘導(dǎo)的超氧化物生成。以上研究表明NOX2參與了AD的病理過(guò)程，但對(duì)于在AD中起重

7、要作用的膽堿能神經(jīng)元中，在AD病理?xiàng)l件下NOX2亞基的表達(dá)變化尚未見報(bào)道。
　　線粒體在能量代謝及電子鏈傳遞中可產(chǎn)生ROS，在病理?xiàng)l件下可出現(xiàn)代謝紊亂，大量ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。腦內(nèi)線粒體的含量是肝臟或心臟的七倍，諸多研究發(fā)現(xiàn)線粒體參與了AD的病理過(guò)程，在氧化應(yīng)激損傷中起重要的作用。一些基于血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，作為細(xì)胞內(nèi)ROS兩個(gè)主要來(lái)源，線粒體與NOX之間可能存在相互作用，兩者可能通過(guò)產(chǎn)生的ROS而相互激活，導(dǎo)致氧化應(yīng)激

8、加劇，細(xì)胞凋亡。然而在AD的病理?xiàng)l件下，神經(jīng)元內(nèi)線粒體與NOX2之間是否也存在相互作用，通過(guò)對(duì)線粒體進(jìn)行干預(yù)是否可影響NOX2，目前尚未見報(bào)道。
　　近年來(lái)不少研究表明線粒體ATP敏感性鉀離子通道(MitochondrialATP-sensitive potassium channel，MitoKATP)可能是各種腦預(yù)適應(yīng)的一個(gè)觸發(fā)器和（或）效應(yīng)器。無(wú)論是在體內(nèi)還是體外，MitoKATP均參與預(yù)處理對(duì)腦的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用大

9、多數(shù)可被MitoKATP拮抗劑5-羥葵酸(5-hydroxydecanoate，5-HD)所逆轉(zhuǎn)。
　　目的:本研究利用Aβ1-42作用原代培養(yǎng)的大鼠膽堿能神經(jīng)元作為AD的病理模型，用二氮嗪作為MitoKATP通道激活劑，以DPI為NOX2的阻斷劑，對(duì)以下問(wèn)題進(jìn)行探討:
　　1.觀察Aβ1-42對(duì)原代培養(yǎng)膽堿能神經(jīng)元內(nèi)ROS和細(xì)胞活性的影響以及對(duì)NOX2主要亞基表達(dá)的影響，探討Aβ1-42致氧化應(yīng)激的機(jī)制。
　　2.觀

10、察DPI對(duì)Aβ142作用原代培養(yǎng)膽堿能神經(jīng)元內(nèi)ROS生成以及細(xì)胞活性的影響，探討NOX2是否參與Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。
　　3.觀察預(yù)激活MitoKATP對(duì)Aβ1-42作用原代培養(yǎng)膽堿能神經(jīng)元內(nèi)ROS和細(xì)胞活性的影響以及對(duì)NOX2主要亞基表達(dá)的影響，探討在AD的病理?xiàng)l件下，神經(jīng)元內(nèi)線粒體與NOX2之間是否存在相互作用，通過(guò)預(yù)激活MitoKATP是否可影響神經(jīng)元NOX2的表達(dá)，從而起到抗氧化應(yīng)激的作用。
　　方

11、法:1.大鼠膽堿能神經(jīng)元的培養(yǎng)和鑒定:無(wú)菌條件下取孕16-18d Wistar胎鼠大腦，解剖顯微鏡下剝?nèi)』浊澳X組織，去除腦膜和血管等雜質(zhì)，用0.125％的胰蛋白酶消化，以含10％胎牛血清及2％B27的高糖DMEM培養(yǎng)。膽堿能神經(jīng)元鑒定采用膽堿乙?；福–holine acetylase，ChAT）免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。
　　2.試驗(yàn)分組:隨機(jī)分為6個(gè)組:對(duì)照組、Aβ1-42處理組（2μMAβ1-42處理24h或72h）、二氮嗪預(yù)處理

12、+Aβ1-42干預(yù)組（500μM二氮嗪預(yù)處理1h后加入Aβ142處理24h或72h）、DPI預(yù)處理+Aβ1-42干預(yù)組（1μM DPI預(yù)處理1h后加入Aβ1-42處理24h或72h）、DPI預(yù)處理組（1μM DPI預(yù)處理1h）、二氮嗪預(yù)處理組（500μM二氮嗪預(yù)處理1h）;各組又分為24h和72h兩個(gè)亞組。
　　3.細(xì)胞活性的檢測(cè):膽堿能神經(jīng)元分組培養(yǎng)并藥物處理后，使用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活性的變化。
　　4.細(xì)胞內(nèi)ROS及M

13、DA的檢測(cè):用氧化敏感的熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，用脂質(zhì)氧化MDA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞MDA水平的變化。
　　5.NOX2亞基表達(dá)的檢測(cè):免疫熒光雙染及免疫印跡觀察干預(yù)不同時(shí)間后膽堿能神經(jīng)元NOX2主要亞基gp91 phox和p47phox蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:1.大鼠膽堿能神經(jīng)元的培養(yǎng)和鑒定:ChAT是乙酰膽堿的合成酶，是突觸前膽堿合成的標(biāo)志酶，培養(yǎng)的神經(jīng)元在第7天行ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)

14、果顯示90％以上為膽堿能神經(jīng)元。
　　2.通過(guò)MTT檢測(cè)膽堿能神經(jīng)細(xì)胞活性，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，Aβ1-42處理組細(xì)胞活性較對(duì)照組顯著下降(24h亞組P＜0.05，72h亞組P＜0.001)，而二氮嗪或DPI預(yù)處理+Aβ1-42干預(yù)組與對(duì)照組相比24h亞組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，72h亞組細(xì)胞活性明顯下降(P＜0.01)，但較Aβ1-42處理組明顯升高(P＜0.01)，提示具有抵抗Aβ1-42神經(jīng)毒性的作用。
　　3

15、.免疫熒光雙染及免疫印跡結(jié)果顯示，Aβ1-42處理組與對(duì)照組相比，gp91phox及p47phox表達(dá)顯著升高（24h亞組P＜0.01，72h亞組P＜0.001）;二氮嗪預(yù)處理+Aβ1-42干預(yù)組（24h亞組）與Aβ1-42處理組(24h亞組)比較gp91phox及p47phox顯著下調(diào)(P＜0.01)，與對(duì)照組(24h亞組)比較無(wú)明顯變化，表明二氮嗪預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)Aβ1-42誘導(dǎo)的NOX2表達(dá)上調(diào);二氮嗪預(yù)處理+Aβ1-42干預(yù)組(72

16、h亞組)與Aβ1-42處理組(72h亞組)比較gp91phox及p47phox顯著下調(diào)(P＜0.05)，與對(duì)照組(72h亞組)比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明二氮嗪僅能部分逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)上調(diào)，但仍有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于NOX2表達(dá)增加可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加，這些結(jié)果表明二氮嗪可能通過(guò)降低NOX2的表達(dá)來(lái)抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的ROS生成。
　　4.為證實(shí)二氮嗪及DPI預(yù)處理可以抑制Aβ1-42導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，我們檢測(cè)了Aβ1-42處理

17、膽堿能神經(jīng)元后ROS及MDA的水平。結(jié)果顯示Ah-42處理組膽堿能神經(jīng)元內(nèi)ROS及MDA水平較對(duì)照組顯著升高（24h亞組P＜0.01，72h亞組P＜0.001），而二氮嗪或DPI預(yù)處理+Aβ1-42干預(yù)組神經(jīng)元ROS及MDA的水平較Aβ1-42處理組明顯降低（24h亞組P＜0.05，72h亞組P＜0.01），表明二氮嗪或DPI均可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的ROS及MDA生成，減輕氧化應(yīng)激。
　　結(jié)論:1.Aβ142可導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)元N

18、OX2主要亞基gp91phox和p47phox表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加，引起氧化應(yīng)激。
　　2.DPI可抑制NOX2的活性，降低神經(jīng)元內(nèi)ROS的生成，從而抑制Aβ1-42導(dǎo)致的膽堿能神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，表明NOX2參與了Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。
　　3.通過(guò)二氮嗪預(yù)激活MitoKATP可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元NOX2的表達(dá)上調(diào)，減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，從而起到抗氧化應(yīng)激的作用，表明在A