E2F1-Topo IIβ信號(hào)途徑在SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)元分化中的作用.pdf

1、在哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)育中，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。其中，神經(jīng)元分化對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的形成是非常重要的。神經(jīng)元分化過(guò)程中，信號(hào)分子與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化緊密協(xié)調(diào)，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育與成熟。探討神經(jīng)元分化調(diào)控的分子機(jī)制對(duì)于神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)再生、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以及腦腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療有重要意義。
　　拓?fù)洚悩?gòu)酶IIβ（Topoisomerase IIβ，Topo IIβ）是促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元分化的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。腺病毒E

2、2轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子-1（E2F1）是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化進(jìn)程中，發(fā)揮著重要作用。西洛他唑（cilostazol，CLZ）是抗血小板類(lèi)藥物，對(duì)神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用，而且最近有研究報(bào)道 CLZ可干擾 E2F1與其靶基因的結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)元分化，但其確切作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞為神經(jīng)元分化模型，通過(guò)外源性上調(diào)E2F1的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞分化過(guò)程中E2F1和Topo IIβ的表達(dá)變化，

3、進(jìn)而探討神經(jīng)元分化的分子機(jī)制，為臨床神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究與治療提供一些依據(jù)。本研究共分三部分。
　　第一部分：E2F1對(duì)維甲酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化的影響
　　目的：
　　研究轉(zhuǎn)錄因子E2F1轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，觀(guān)察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響，以及與維甲酸（Retinoic acid，RA）誘導(dǎo)神經(jīng)元分化之間的關(guān)系。
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：SH-SY5Y細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、飽和濕度、5％C

4、O2環(huán)境下培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。
　　2.E2F1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：E2F1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒用 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡、qRT-PCR以及Western blot觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率。
　　3.誘導(dǎo)分化：E2F1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，加入維甲酸（RA）10μmol/L誘導(dǎo)分化3d。
　　4.細(xì)胞生長(zhǎng)狀況檢測(cè)：MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，倒

5、置顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞分化形態(tài)。
　　5.細(xì)胞周期檢測(cè)：收集各組細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞百分比。
　　6.各組細(xì)胞神經(jīng)元分化的鑒定：神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的檢測(cè)；MAP2表達(dá)的免疫熒光及蛋白印跡檢測(cè)。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，單因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05為有顯著性意義。
　　結(jié)果：
　　1.SH-SY5Y細(xì)胞呈貼壁、簇狀生長(zhǎng)，胞體小而圓，大

6、多數(shù)為不規(guī)則形，少數(shù)呈梭形，有較短的神經(jīng)突起。
　　2.倒置熒光顯微鏡、qRT-PCR以及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率
　　E2F1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒帶有綠色熒光，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染E2F1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入 SH-SY5Y細(xì)胞1d、2d、3d后，倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，從而判斷轉(zhuǎn)染效率在80%以上。轉(zhuǎn)染后提取E2F1總RNA及總蛋白，采用qRT-PCR以及Western blot技術(shù)檢測(cè)

7、，在E2F1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中 E2F1的mRNA及蛋白水平都有顯著增高，與未轉(zhuǎn)染組和空載體組相比，有顯著性差異（P<0.05）。說(shuō)明過(guò)表達(dá) E2F1質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入SH-SY5Y細(xì)胞。
　　3.細(xì)胞生長(zhǎng)狀況
　　SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染E2F1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，MTT結(jié)果顯示：與對(duì)照組（Con）相比，E2F1過(guò)表達(dá)組（over）細(xì)胞生長(zhǎng)最快，二者有顯著性差異（P<0.05）。轉(zhuǎn)染后加入10μmol/L RA誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)組（Con

8、+RA）與對(duì)照組（Con）相比，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯降低，而E2F1過(guò)表達(dá)組加入RA后（over+RA），生長(zhǎng)速度沒(méi)有明顯降低，與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異。
　　4.細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)變化
　　E2F1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，加入或不加10μmol/L RA誘導(dǎo)分化，3 d后倒置顯微鏡下觀(guān)察：RA未處理組中，過(guò)表達(dá)組（over）細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組（Con）相比，無(wú)明顯區(qū)別；在RA處理組中，與未誘導(dǎo)組相比，RA誘導(dǎo)分化組細(xì)胞數(shù)目減

9、少，胞體聚集生長(zhǎng)，神經(jīng)突起長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)。對(duì)單個(gè)細(xì)胞平均神經(jīng)突起長(zhǎng)度測(cè)量，結(jié)果顯示：Con+RA組與Con組相比，有顯著性差異（P<0.05）；而over+RA組的SH-SY5Y細(xì)胞突起長(zhǎng)度增加不明顯。
　　5.轉(zhuǎn)染E2F1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞周期分布的影響
　　E2F1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，流式結(jié)果顯示：E2F1過(guò)表達(dá)組（over）G0/G1期細(xì)胞比對(duì)照組（Con）減少了7.354%，S期增加了5.071%，與對(duì)照

10、組（Con）相比，二者有顯著性差異（P<0.05），而空載體組（overC）與對(duì)照組（Con）相比沒(méi)有顯著性差異。轉(zhuǎn)染后RA誘導(dǎo)細(xì)胞分化3 d，Con+RA組與Con組細(xì)胞相比，G0/G1期細(xì)胞明顯增多，比Con組增加了23.597%，S期細(xì)胞明顯降低，減少了28.410%，表明發(fā)生了G0/G1期阻滯（P<0.05）；over+RA組與Con組細(xì)胞相比，G0/G1期細(xì)胞增加了8.224%，S期減少了9.942%（P<0.05）。提示RA

11、可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，過(guò)表達(dá)E2F1可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　6.神經(jīng)元分化的鑒定
　　采用神經(jīng)元分化標(biāo)志分子，微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein2，MAP2）鑒定神經(jīng)元分化。免疫熒光染色結(jié)果表明，E2F1過(guò)表達(dá)組（over）與對(duì)照組（Con）相比，MAP2的表達(dá)較弱；10μmol/L RA處理SH-SY5Y細(xì)胞后，MAP2不僅在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)增加，而且在神經(jīng)元的突起中表達(dá)也明顯增加，

12、Con+RA組與 Con組細(xì)胞相比，有明顯增加。而over+RA組MAP2表達(dá)量較低，與Con組相比，沒(méi)有明顯區(qū)別。Western blot檢測(cè)MAP2表達(dá)，顯示的結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致。
　　結(jié)論：SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)10μmol/L RA誘導(dǎo)可使細(xì)胞脫離細(xì)胞周期，并向神經(jīng)元分化；E2F1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞增殖，降低神經(jīng)元分化；研究結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)E2F1水平可影響神經(jīng)元分化，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
　　第

13、二部分：E2F1通過(guò)負(fù)調(diào)控Topo IIβ表達(dá)抑制SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化
　　目的：檢測(cè)E2F1和Topo IIβ表達(dá)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：SH-SY5Y細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　2.免疫熒光、qRT-PCR以及Western blot檢測(cè)E2F1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對(duì)Topo IIβ表達(dá)變化的影響。

14、>　　3.qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p27、cyclinD1、CDK4、E2F1 mRNA及蛋白表達(dá)變化的影響。
　　4.染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）檢測(cè)E2F1在Topo IIβ基因啟動(dòng)子區(qū)的募集與結(jié)合。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染E2F1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞中Topo I

15、Iβ表達(dá)變化的影響
　　免疫熒光染色結(jié)果顯示：Topo IIβ的表達(dá)在細(xì)胞核中，E2F1過(guò)表達(dá)組（over）與對(duì)照組（Con）相比，Topo IIβ的表達(dá)較弱，而空載體組（overC）與對(duì)照組（Con）相比沒(méi)有顯著性差異。10μmol/L RA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞后，Con+RA，overC+RA組與Con組細(xì)胞相比，Topo IIβ表達(dá)明顯增加，而over+RA組Topo IIβ表達(dá)量低于Con組。qRT-PCR以及Weste

16、rn blot檢測(cè)的結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致。
　　2.qRT-PCR檢測(cè)p27、cyclinD1、CDK4、E2F1 mRNA表達(dá)
　　與對(duì)照組細(xì)胞相比，E2F1過(guò)表達(dá)組（over）的p27 mRNA表達(dá)量明顯降低（P<0.05），而cyclinD1、CDK4、E2F1 mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組（P<0.05）。空載體組（overC）與對(duì)照組（Con）相比沒(méi)有顯著性差異。RA誘導(dǎo)后，Con+RA、overC+RA組與Con組

17、細(xì)胞相比，p27 mRNA表達(dá)明顯增加（P<0.05），而over+RA組表達(dá)量低于Con組（P<0.05）；對(duì)于cyclinD1、CDK4、E2F1 mRNA的表達(dá)，Con+RA組低于Con組（P<0.05），而over+RA組高于Con組（P<0.05）。
　　3.Western blot檢測(cè)p27、cyclinD1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表達(dá)與Con相比，over中p27蛋白的表達(dá)量明顯降低（P<0.05），而<

18、br>　　cyclinD1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表達(dá)高于Con（P<0.05），overC與Con相比沒(méi)有顯著性差異。RA誘導(dǎo)后，Con+RA、overC+RA與Con細(xì)胞相比，p27蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05），而over+RA組的表達(dá)量低于Con組（P<0.05）；對(duì)于cyclinD1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表達(dá)，Con+RA組低于Con組（P<0.05），而over+RA組高于Con組（P<0.05）

19、。
　　4.E2F1在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)反饋調(diào)節(jié)Topo IIβ的表達(dá)
　　ChIP檢測(cè)顯示，Topo IIβ基因啟動(dòng)子區(qū)有 E2F1的結(jié)合位點(diǎn)，E2F1過(guò)表達(dá)組中，結(jié)合在 Topo IIβ上的E2F1表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高了（P<0.05）。RA誘導(dǎo)后，隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長(zhǎng)，特異性結(jié)合在Topo IIβ基因啟動(dòng)子區(qū)的E2F1逐漸減少，Con+RA組的表達(dá)量低于Con組（P<0.05），over+RA組高于Con組（P<0.05

20、）。說(shuō)明結(jié)合在Topo IIβ基因啟動(dòng)子區(qū)的E2F1與細(xì)胞的分化狀態(tài)成反比，高表達(dá)的E2F1在RA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化過(guò)程中，通過(guò)抑制Topo IIβ的表達(dá)，抑制了細(xì)胞的分化。
　　結(jié)論：
　　RA誘導(dǎo)可降低SH-SY5Y細(xì)胞中E2F1的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，其作用與Topo IIβ的表達(dá)上調(diào)有關(guān)；細(xì)胞內(nèi)E2F1水平增高可促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制神經(jīng)元分化；E2F1可作用于Topo IIβ基因啟動(dòng)子，在神經(jīng)元分

21、化進(jìn)程中調(diào)控Topo IIβ表達(dá)；高表達(dá)的E2F1增強(qiáng)了其在Topo IIβ基因啟動(dòng)子區(qū)的募集，抑制Topo IIβ的表達(dá)，進(jìn)而抑制神經(jīng)元分化。
　　第三部分：西洛他唑通過(guò)E2F1/Topo IIβ途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元分化
　　目的：
　　探討CLZ誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中，Topo IIβ的表達(dá)變化，以及E2F1/Topo IIβ途徑對(duì)神經(jīng)元分化的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：S

22、H-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　2.MTT檢測(cè)CLZ對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的作用濃度。
　　3.細(xì)胞分化百分率檢測(cè)：不同濃度的CLZ作用于人SH-SY5Y細(xì)胞，分別在0~5d觀(guān)察、測(cè)量各組細(xì)胞突起長(zhǎng)度的變化。以單個(gè)細(xì)胞總突起長(zhǎng)度大于100μm作為細(xì)胞分化標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算細(xì)胞分化百分率。
　　4.細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)觀(guān)察：30μ

23、mol/L CLZ作用于人SH-SY5Y細(xì)胞0~3 d，觀(guān)察CLZ處理前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，檢測(cè)分化情況。
　　5.神經(jīng)元分化的鑒定：免疫熒光及Western blot技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元分化標(biāo)志蛋白MAP2的表達(dá)。
　　6.Topo IIβ的表達(dá)：分別用免疫熒光、qRT-PCR技術(shù)以及Western blot檢測(cè)Topo IIβ在CLZ處理前后的表達(dá)變化。
　　7.qRT-PCR技術(shù)以及Western blot檢測(cè)p27、E

24、2F1、PCNA在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　8.ChIP檢測(cè)E2F1在Topo IIβ以及增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.MTT結(jié)果顯示：不同濃度的CLZ（10、20、50、100、200、400μmol/L）作用于SH-SY5Y細(xì)胞1、2、3、4、5 d后可抑制細(xì)

25、胞的增殖，隨著CLZ濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增大，與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示CLZ對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。應(yīng)用半數(shù)抑制濃度（IC50）計(jì)算軟件計(jì)算CLZ對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的IC50：第1~5 d分別為：167.472±6.289、76.334±2.549、36.629±3.148、31.382±2.148、28.146±1.485μmol/L。

26、>　　2.細(xì)胞分化百分率
　　CLZ誘導(dǎo)細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中，10、20、50μmol/L CLZ在1~3 d細(xì)胞分化百分率逐漸增加，第3 d達(dá)到最高，結(jié)合MTT計(jì)算的CLZ對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞第1~5 d的IC50結(jié)果，因此選用30μmol/L CLZ誘導(dǎo)細(xì)胞分化3 d，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
　　3.細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)變化
　　與對(duì)照組相比，CLZ誘導(dǎo)組細(xì)胞逐漸出現(xiàn)增殖速度下降，細(xì)胞數(shù)目減少，突起伸出，且突起數(shù)量和長(zhǎng)度逐漸增

27、加。誘導(dǎo)第3 d，細(xì)胞具有多個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起，且突起的長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)，交織成網(wǎng)狀，具備成熟神經(jīng)元的形態(tài)特點(diǎn)，與對(duì)照組細(xì)胞相比有顯著性差異（P<0.05）。
　　4.神經(jīng)元分化的鑒定
　　免疫熒光檢測(cè)MAP2表達(dá)情況，結(jié)果顯示：30μmol/L CLZ誘導(dǎo)細(xì)胞向神經(jīng)元分化3d后，突起長(zhǎng)度明顯增加，與對(duì)照組細(xì)胞相比有明顯差異（P<0.05）。Western blot同樣顯示MAP2蛋白表達(dá)增高，與對(duì)照組細(xì)胞相比有顯著性差異（P<0.05

28、），說(shuō)明30μmol/L CLZ可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化。
　　5.Topo IIβ的表達(dá)檢測(cè)
　　免疫熒光檢測(cè)Topo IIβ表達(dá)情況，結(jié)果顯示：CLZ誘導(dǎo)組細(xì)胞核染色明顯加深，qRT-PCR、Western blot均顯示Topo IIβ表達(dá)增高，與對(duì)照組細(xì)胞相比有明顯差異（P<0.05）。
　　6.p27、E2F1和PCNA的表達(dá)變化
　　CLZ誘導(dǎo)細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中p27在mRNA和蛋白

29、水平均高于對(duì)照組細(xì)胞，有明顯差異（P<0.05），而E2F1、PCNA均低于對(duì)照組細(xì)胞，有顯著性差異（P<0.05），說(shuō)明30μmol/L CLZ可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖。
　　7.CLZ影響E2F1在Topo IIβ和PCNA基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合
　　ChIP檢測(cè)顯示，CLZ誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中，結(jié)合在Topo IIβ和PCNA基因啟動(dòng)子區(qū)的E2F1蛋白受到明顯抑制（P<0.05）。提示：E2F

30、1/Topo IIβ途徑參與了CLZ誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化，CLZ促進(jìn)了Topo IIβ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制了細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了細(xì)胞的分化。
　　結(jié)論：
　　本部分研究以E2F1正向調(diào)控的靶基因PCNA作為對(duì)照，探討了CLZ對(duì)E2F1和Topo IIβ表達(dá)的影響。結(jié)果提示，CLZ可通過(guò)抑制E2F1與Topo IIβ基因結(jié)合作用，誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化；從而進(jìn)一步證明E2F1/Topo IIβ信號(hào)途徑參與了