天麻素對大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、缺血缺氧性腦損傷(hypoxie-isehemic brain damage,HIBD)是一種高致殘、高致死性的常見疾病.HIBD是一個復(fù)雜的病理過程,能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸(excitatory amino acids,EAAs)產(chǎn)生過多和一氧化氮(nitric oxide,NO)蓄積等在級聯(lián)的細(xì)胞毒作用中具有重要作用.這些機(jī)制相互關(guān)聯(lián),相互促進(jìn),導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞損傷的惡性循環(huán).目前認(rèn)為,實施神經(jīng)保護(hù)治療是提高缺血缺氧

2、性腦損傷治療有效性的根本措施,其作用機(jī)制在于通過阻斷缺血缺氧(hypoxic-isehemic,HI)所致各類有害變化的病理過程的發(fā)生,減輕腦組織的進(jìn)一步損傷,促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù).目前,雖然一些西藥相繼應(yīng)用于實踐,但由于副作用而限制了其臨床進(jìn)一步應(yīng)用.天然藥物由于具有作用機(jī)制的多靶點和低毒性的特點,已被廣泛用于神經(jīng)保護(hù)藥物的研究.因此,缺血缺氧性腦損傷防治藥物的開發(fā),對防治腦缺血缺氧性細(xì)胞損傷的發(fā)生,改善疾病預(yù)后具有重要意義.神經(jīng)保護(hù)劑

3、的研制和應(yīng)用已成為缺血缺氧性腦損傷防治研究的焦點,具有廣闊的發(fā)展應(yīng)用前景. 天麻素(Gastrodin,Gas)是我國傳統(tǒng)中藥天麻的主要藥用成分,化學(xué)名為4-羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷.藥理試驗表明:天麻素是一種安全的鎮(zhèn)靜藥,具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、改善心腦血管功能及抗炎、抗自由基等作用.其特點是安全低毒,不易產(chǎn)生藥物蓄積;無藥物依賴性、成癮性等優(yōu)點.近年來的研究表明天麻素能夠增強(qiáng)血管的順應(yīng)性,改善臟器缺氧狀態(tài),對一些由腦供血不足造

4、成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有較好的治療作用,但其在神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方面的作用機(jī)理尚缺乏更為深入的研究. 本課題擬在已有研究的基礎(chǔ)上,以體外培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞為研究對象,造成體外缺血缺氧損傷模型,利用生化及分子生物學(xué)技術(shù),旨在探討天麻素對神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能的分子機(jī)制,期望為缺血缺氧性腦血管病的防治提供理論基礎(chǔ),具有實用意義. 材料與方法 1.Wistar:大鼠(孕16-19天)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng).

5、 2.用缺糖和充氮氣的方法制備缺血缺氧細(xì)胞損傷模型.制備模型時無糖Earle's液和氮氣作用5小時.培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分為3組:正常對照組、缺血缺氧損傷組和天麻素組,天麻素組中分別加入13mg/L、26mg/L、52mg/L終濃度的天麻素. 3.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變. 4.臺盼蘭染色法觀察細(xì)胞的存活率. 5.試劑盒測定法檢測細(xì)胞NO和乳酸脫氫酶(1actate dehydrogenase,LDH

6、)的釋放. 6.RT-PCR:法檢測神經(jīng)細(xì)胞NR1 mRNA的表達(dá)以及天麻素對其表達(dá)的影響. 7.使用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析.所有數(shù)據(jù)用X±S示,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05表明有統(tǒng)計學(xué)意義. 結(jié)果 1.天麻素對神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變倒置顯微鏡下活細(xì)胞觀察:正常對照組細(xì)胞胞體豐滿,突起較長,連成網(wǎng)狀;缺血缺氧損傷組,大部分細(xì)胞腫脹,壞死;加入天麻素各組,細(xì)

7、胞形態(tài)有所改善,較多細(xì)胞保留突起結(jié)構(gòu),腫脹細(xì)胞及細(xì)胞碎片均明顯減少,以26mg/L濃度組細(xì)胞形態(tài)改善最為明顯. 2.天麻素對神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響臺盼蘭染色結(jié)果顯示:神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧損傷后,細(xì)胞存活率明顯降低,與正常對照組相比有顯著性差異(P

8、最佳.提示天麻素對損傷的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用. 3.天麻素對神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量和LDH活性的影響缺血缺氧損傷組細(xì)胞培養(yǎng)液NO水平與正常對照組相比顯著升高(P<0.01);不同濃度(13mg/L、26mg/L、52mg/L)天麻素各組與損傷組相比,培養(yǎng)液中NO水平顯著降低(P<0.05).損傷組細(xì)胞釋放至培養(yǎng)液中的LDH(1788.5±129.2 U/L)與正常對照組(874.56+98.18 U/L)相比顯著性升高(P<0.

9、01);加入濃度為13mg/L,26mg/L和52mg/L天麻素可顯著降低LDH的漏出,與損傷組相比P<0.05. 4.天麻素對大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞NR1 mRNA表達(dá)的影響: 采用RT-PCR法對缺血缺氧損傷神經(jīng)細(xì)胞的NR1 mRNA進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:損傷組細(xì)胞NR1 mRNA的相對表達(dá)量(0.901±0.106)與正常對照組(0.146+0.046)相比明顯升高,統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性意義(P<0.01);不同濃度(1

10、3mg/L、26mg/L、52mg/L)天麻素各組均能顯著抑制NR1 mRNA的表達(dá)(P均<0.01),各組相對表達(dá)量分別為0.659±0.134、0.297±0.046和0.334+0.056, 以26mg/L濃度天麻素組抑制作用最強(qiáng). 結(jié)論 天麻素可明顯改善缺血缺氧神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)、提高細(xì)胞的存活率、減少細(xì)胞NO和LDH的釋放以及抑制神經(jīng)細(xì)胞NR1 mRNA的表達(dá).其作用機(jī)制可能通過抑制神經(jīng)細(xì)胞NR1 mRNA的表達(dá),