中華蜜蜂硫氧還蛋白過氧化物酶、硫氧還蛋白和谷氧還蛋白相關(guān)基因功能分析.pdf

1、硫氧還蛋白過氧化物酶(Tpxs)、硫氧還蛋白(Trxs)和谷氧還蛋白(Grxs)作為生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，在維持氧化還原平衡和保護機體免受ROS損傷方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前關(guān)于Tpxs、 Trxs和Grxs基因的研究主要在哺乳動物、果蠅等模式物種，中華蜜蜂(Apis cerana cerana)中關(guān)于此類基因的研究很少。中華蜜蜂是我國特有的種質(zhì)資源，它耐寒抗病，在維持自然體系生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用。然而由于環(huán)境污染、濫用殺蟲劑

2、和感染性疾病等使中華蜜蜂的生存環(huán)境變得越來越惡劣，因此保護中華蜜蜂這一重要的種質(zhì)資源變得越來越緊迫。為了深入了解中華蜜蜂抗逆性作用機制，本研究從中華蜜蜂中克隆得到與抗氧化密切相關(guān)的五個新基因，并對它們進行了氨基酸序列比對、表達特性和功能分析，具體結(jié)果如下:
　　(1)從中華蜜蜂中分離得到Tpx-3、Trx2、Grx1、Grx2和Trx1基因，并分別命名為AccTpx-3、AccTrx2、AccGrx1、AccGrx2和AccTrx

3、1，氨基酸序列比對、進化樹和基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)以上中華蜜蜂抗氧化基因與意大利蜜蜂同類抗氧化基因的同源性較高，并且擁有高度保守的酶催化活性位點。
　　(2)利用qRT-PCR方法對中華蜜蜂以上五個基因在不同發(fā)育時期的表達特性進行了研究，研究結(jié)果表明，AccTpx-3在4日齡幼蟲表達量最高，其次在15日齡成蟲表達量較高;AccTrx2在15日齡成蟲中表達量最高，其次在4日齡幼蟲和黑眼蛹中表達量較高;AccGrx1、AccGrx2在黑眼

4、蛹中表達量最高;AccTrx1在15日齡成蟲表達量最高。
　　(3)利用qRT-PCR方法對中華蜜蜂以上五個基因在15日齡成蟲不同組織部位的表達特性進行了研究，研究結(jié)果表明AccTpx-3、AccTrx2、AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1分別在肌肉、腦部、脂肪體、肌肉和表皮中表達量最高。
　　(4)另外，采用qRT-PCR方法對以上五個基因在多種非生物氧化應(yīng)激中的表達特性進行了分析，研究結(jié)果表明以上五個基因受溫

5、度、過氧化氫、農(nóng)藥等非生物應(yīng)激處理誘導表達，說明以上五個基因參與抗氧化作用從而保護中華蜜蜂免受由ROS造成的氧化損傷。
　　(5)將在大腸桿菌中表達的AccTpx-3和AccTrx2進行純化并經(jīng)SDS-PAGE檢測純化效果后，利用MFO系統(tǒng)檢測分析純化蛋白功能，發(fā)現(xiàn)純化的AccTpx-3和AccTrx2具有保護DNA免受ROS損傷的功能;另外在大腸桿菌BL21菌株中表達AccTpx-3可以減輕因百草枯導致的氧化損傷;純化AccTr

6、x2具有還原胰島素的能力，說明其為典型的硫氧還蛋白。
　　(6)利用體外合成的dsRNA將AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1分別成功沉默后發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂體內(nèi)的CAT、POD酶活性，過氧化氫、蛋白質(zhì)羰基、維生素C含量，GSH/GSSG、NADP+/NADPH的比率均升高，說明有其他抗氧化相關(guān)基因參與彌補被沉默基因的功能缺失。
　　(7)將AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx