利迪鏈霉菌Ⅰ型聚酮合成酶基因克隆及功能研究.pdf

1、為了研究Ⅰ型聚酮合成酶特別是硫酯酶在鏈霉菌中acyltetramic acid類(lèi)抗生素合成中的作用,以利迪鏈霉菌為例,改進(jìn)PCR方法,運(yùn)用基因阻斷技術(shù)和LC/MS分析方法,試圖從分子水平研究Ⅰ型聚酮合成酶中的酮?；铣擅?、硫酯酶以及抗生素合成基因簇中的修飾酶S-腺苷蛋氨酸合成酶和細(xì)胞色素P450在利迪鏈菌素生物合成中的作用.運(yùn)用FTIR技術(shù)測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體,紅外數(shù)據(jù)用PCA、HCA和ANN分析,試圖找到利迪鏈霉菌開(kāi)始合成利迪鏈菌素時(shí)

2、的biomarker,以及用于突變株高通量篩選的方法.獲得如下主要結(jié)果: 針對(duì)鏈霉菌基因組DNA高GC含量的特點(diǎn),改進(jìn)了PCR體系.用改進(jìn)的PCR體系克隆得到了硫酯酶Ⅱ、3-氧酰基-ACP合成酶Ⅱ、S-腺苷蛋氨酸合成酶以及細(xì)胞色素P450的基因片段,并確定3-氧?；?ACP合成酶Ⅱ、硫酯酶Ⅱ和S-腺苷蛋氨酸合成酶參與了利迪鏈菌素的生物合成,而擴(kuò)增得到細(xì)胞色素P450對(duì)利迪鏈菌素的合成沒(méi)有直接影響.同時(shí)發(fā)現(xiàn),鏈霉菌中acyltet

3、ramic acid類(lèi)抗生素利迪鏈菌素的生物合成需要硫酯酶,不同于目前在真菌中發(fā)現(xiàn)的2種同類(lèi)抗生素equisetin和fusarin C的生物合成. 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加L-蛋氨酸,L-賴氨酸,L-精氨酸、L-異亮氨酸和L-色氨酸,引起菌體細(xì)胞內(nèi)S-腺苷蛋氨酸含量的下降,導(dǎo)致利迪鏈菌素含量的下降,其中以蛋氨酸和精氨酸的效果最為顯著.S-腺苷蛋氨酸可以提高利迪鏈菌素的產(chǎn)量,表明L-蛋氨酸不是利迪鏈菌素生物合成的直接前體,而主要是通過(guò)合

4、成S-腺苷蛋氨酸,提供利迪鏈菌素結(jié)構(gòu)中的N-甲基.H<,2>O<,2>通過(guò)誘導(dǎo)蛋白的表達(dá),改變了菌體的正常代謝途徑,降低了利迪鏈菌素的產(chǎn)量并積累了其他物質(zhì). 運(yùn)用FTIR技術(shù)結(jié)合PCA、HCA,很好地區(qū)分了處于不同發(fā)酵時(shí)間的利迪鏈霉菌AS 4.2501,并找到了利迪鏈霉菌合成利迪鏈菌素時(shí)可能的生物標(biāo)志物(biomarkers)；嘗試用FTIR技術(shù)結(jié)合ANN較好地預(yù)測(cè)了具有不同利迪鏈菌素合成能力的利迪鏈霉菌的突變株.表明基于代謝物