油菜脂?！狝CP硫酯酶基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、油料作物種子的油脂是人類重要的營養(yǎng)和工業(yè)原料，有效提高其含油量和調(diào)控油脂成分成為提升油料作物生產(chǎn)效益的重要課題。因此，從油料作物中克隆、分析和鑒定硫酯酶基因(Fat)對于人工調(diào)控其含油量和油脂成分的研究具有重要意義。本論文主要通過從油菜種子中克隆植物酯酰?；d體蛋白硫酯酶基因BnFatB，分析和鑒定了其生物學(xué)功能，從而為改造油菜脂肪酸方面提供了重要的理論依據(jù)。
　　 植物脂酰一酰基載體蛋白硫酯酶(Fat)是一種終止脂肪酸合成的酶

2、。它的基本功能就是將acyl-ACPs水解成游離脂肪酸和ACP，從而可達(dá)到終止脂肪酸從頭合成途徑中脂肪酸鏈延長過程的效果。植物中，不同的Fat具有其不同的底物特異性，直接決定了植物代謝過程中細(xì)胞油脂中脂肪酸的成分種類與數(shù)量。在不同植物物種及其組織中對于每種脂肪酸的需求量各不相同，因此at在植物細(xì)胞油脂代謝中就有著極其重要的作用。
　　 本研究根據(jù)擬南芥AtFatB(GenBank:NM100724.2)基因序列利用同源序列克隆法

3、從油菜品系寧油12種子的cDNA中克隆出一個(gè)全長為1350 bp的FatB基因，命名為BnFatB，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，BnFatB含有一個(gè)長度為1245 bp的開放閱讀框(ORF)，預(yù)測是編碼一個(gè)含有414個(gè)氨基酸殘基，其分子量為47.6 kDa，等電點(diǎn)為8.82的多肽，其中1-96位氨基酸為N-末端的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的裂解位點(diǎn)，H319和C354為該序列中兩個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基。序列分析顯示，BnFatB的編碼氨基酸序列與

4、BjFatB、AtFatB和MtFatB序列高度同源。BnFatB基因序列已遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(GenBank: KC445243)。進(jìn)化分析顯示，BnFatB與BjFatB具有最近的親緣關(guān)系，這也與它們物種間親緣關(guān)系表現(xiàn)一致。
　　 進(jìn)一步分別通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和煙草系統(tǒng)共定位的方法對該基因在油菜中的組織特異表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位作了分析，研究結(jié)果顯示:油菜根、莖、葉、花和角果五個(gè)組織中均有表達(dá)，尤其是在發(fā)育的角果

5、中表達(dá)最顯著;亞細(xì)胞定位表明該基因被定位于葉綠體，與之前生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果一致。油菜油脂積累過程是從發(fā)育的角果到最終成熟的種子中，油脂合成途徑中脂肪酸從頭合成也是始于質(zhì)體，鑒于此，我們初步確定油菜BnFatB在油菜油脂合成途徑中起著重要的作用。
　　 為了探究該基因在油脂代謝途徑中的功能，采用水解蛋白酶缺陷型pep4酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，通過在酵母細(xì)胞內(nèi)異源表達(dá)油菜蛋白BnFatB，分別利用氣相色譜、半定量和蘇丹黑染色的手段對轉(zhuǎn)基因

6、酵母細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:BnFatB基因在酵母細(xì)胞中表達(dá)水平與對照相比明顯增加;酵母脂肪酸的氣相色譜分析表明，與對照組相比C16∶0和C18∶0分別增加45.69％和21.66％;而C16∶1和C18∶1分別下降15.32％和30.58％。
　　 為了更深入鑒定油菜BnFatB的生物學(xué)功能，我們還構(gòu)建了該基因抗性為潮霉素的植物表達(dá)載體pCXSN_CaMV35S_BnFatB_NOS，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸花法轉(zhuǎn)化了甘