甘藍型油菜抗旱相關(guān)基因BnBiP的克隆與功能鑒定.pdf

1、干旱、冷害、鹽堿等非生物逆境嚴重影響了作物產(chǎn)量和品質(zhì)。而干旱是最為普遍的非生物逆境形式，限制了作物的種植范圍，因而抗旱育種顯得尤為重要。本研究從甘藍型油菜中克隆到干旱脅迫相關(guān)基因BnBiP，通過在甘藍型油菜中超量表達，對這個基因的功能進行了分析和鑒定，并對這個基因進行了抗逆性機制的探討。主要結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)已知的大豆中的soyBiPD(Accession no.AF031241)的cDNA序列設計引物從甘藍型油菜中擴增

2、到763bp的片段，再利用Gene RACE的方法獲得BnBiP的cDNA序列。BnBiP基因最大開放閱讀框為1991bp編碼了650 aa。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對BnBiP基因編碼的蛋白質(zhì)序列進行結(jié)構(gòu)和功能預測，發(fā)現(xiàn)BnBiP基因在植物中是高度保守的，其編碼序列內(nèi)有3個Hsp70保守結(jié)構(gòu)域。
　　 2.在載體pBI121（含CaMV35S啟動子）的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了Bn

3、BiP超量表達載體。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化甘藍型油菜，得到21株T0代卡那霉素抗性超量表達目的基因的株系。PCR結(jié)果分析顯示，目的基因已整合到抗性植株中。RT-PCR和Real-time結(jié)果表明其中16個T0代轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)基因植株BnBiP基因相對于對照表達豐度增加。
　　 3.E3泛素連接酶基因SDIR參與環(huán)境脅迫下的ABA信號轉(zhuǎn)導途徑，在擬南芥中超量表達SDIR可提高其抗旱性(Zhang et al;2007)。

4、酵母雙雜交結(jié)果顯示，BnBiP蛋白和SDIR蛋白之間無互作關(guān)系，據(jù)此推測BnBiP未參與SDIR基因所介導的植物抗逆途徑。
　　 4.衣霉素通過抑制細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的糖基化導致未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積累，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。超量表達BnBiP的T0代種子在含有5μg/ml衣霉素的培養(yǎng)基上發(fā)芽率高于對照，且超量表達BnBiP的T1代植株在衣霉素脅迫下表現(xiàn)出較好的抗性。說明BnBiP作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶，可以減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激脅迫。

5、　　 5.通過RT-PCR和Real-time PCR分析，得出BnBiP的表達受干旱脅迫誘導，其表達量在干旱脅迫1-2h內(nèi)顯著上升。對生長4-6葉期的甘藍型油菜經(jīng)過20％PEG-6000模擬干旱脅迫12h或者斷水處理14d，轉(zhuǎn)基因陽性植株均表現(xiàn)出較強的抗旱性。
　　 6.在20％PEG-6000滲透脅迫下分析BnBiP和其他逆境相關(guān)基因如NRP信號途徑（誘導細胞凋亡途徑）中的AtNRP和GmNAC6基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)與對照