BnTR1在甘藍(lán)型油菜抗旱和耐鹽中的功能鑒定.pdf

1、油菜是我國(guó)乃至全世界主要的一種油料作物，是食用植物油的主要來(lái)源。油菜在其生命歷程中可能遭遇如干旱和高鹽等非生物脅迫，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致產(chǎn)量大大減少。有研究發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶在植物逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，如一些U-box、SCF復(fù)合以及RING-finger等類(lèi)型的E3泛素連接酶能參與植物干旱脅迫應(yīng)答途徑。BnTR1編碼一個(gè)具有RING-finger結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)甘藍(lán)型油菜“揚(yáng)油9號(hào)”(Y9，對(duì)照)及

2、以其為遺傳轉(zhuǎn)化受體獲得的過(guò)表達(dá)BnTR1基因甘藍(lán)型油菜分別進(jìn)行了萌發(fā)期和苗期的干旱和鹽脅迫處理，初步鑒定了BnTR1在甘藍(lán)型油菜抗旱和耐鹽中的生物學(xué)功能，并探究其調(diào)控甘藍(lán)型油菜抗旱性和耐鹽性的分子機(jī)理。本研究的主要結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)PCR對(duì)BnTR1轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜進(jìn)行陽(yáng)性鑒定，并對(duì)得到的T0代陽(yáng)性苗進(jìn)行qPCR檢測(cè)，結(jié)果鑒定得到8棵T0代過(guò)表達(dá)BnTR1植株，過(guò)表達(dá)BnTR1的轉(zhuǎn)基因植株中BnTR1表達(dá)量是Y9中的2.8

3、-6.7倍;之后對(duì)T0代過(guò)表達(dá)植株的T1代幼苗進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到T1代過(guò)表達(dá)BnTR1甘藍(lán)型油菜植株。
　　(2)以Y9作為對(duì)照，考察過(guò)表達(dá)BnTR1甘藍(lán)型油菜T1代植株的農(nóng)藝性狀，包括株高、千粒重、單株產(chǎn)量等性狀，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)BnTR1基因?qū)Ω仕{(lán)型油菜的農(nóng)藝性狀沒(méi)有明顯影響。
　　(3)對(duì)Y9和過(guò)表達(dá)BnTR1基因甘藍(lán)型油菜T1代幼苗進(jìn)行連續(xù)14d斷水的自然干旱脅迫，并測(cè)定處理前后葉片中的相關(guān)生理指標(biāo)，結(jié)果顯示:在干旱脅迫

4、下，T1代過(guò)表達(dá)BnTR1植株的長(zhǎng)勢(shì)明顯比Y9好，且其葉片RWC和RWR較大，可溶性蛋白含量及SOD、POD酶活顯著增加，而MDA含量顯著下降;用PEG-6000對(duì)Y9和過(guò)表達(dá)BnTR1材料的T2代種子處理7d后，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)BnTR1材料種子的發(fā)芽率、苗高和根長(zhǎng)都高于Y9，通過(guò)DAB及NBT染色發(fā)現(xiàn)其葉片中的H2O2和O2-積累較少，且通過(guò)qPCR進(jìn)行的抗氧化酶基因表達(dá)分析表明部分抗氧化酶基因的表達(dá)量明顯升高。
　　(4)用600

5、mMNaC1對(duì)Y9和過(guò)表達(dá)BnTR1基因甘藍(lán)型油菜T1代幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)BnTR1植株的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于Y9，且其葉片中的SOD、CAT及POD的酶活顯著提高，而MDA含量顯著降低;在150 mM NaC1處理?xiàng)l件下，過(guò)表達(dá)BnTR1材料的T2代種子發(fā)芽率、苗高和根長(zhǎng)都比Y9高，通過(guò)DAB及NBT染色發(fā)現(xiàn)其葉片中的H2O2和O2-積累較少，且抗氧化酶基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)部分抗氧化酶基因的表達(dá)量明顯升高。
　　(5)通

6、過(guò)酶切連接的方法構(gòu)建得到用于亞細(xì)胞定位的植物表達(dá)載體pMDC83-BnTR1，并進(jìn)行煙草葉片表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)BnTR1蛋白可能定位于細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中。
　　(6)通過(guò)酶切連接的方法構(gòu)建得到用于酵母雙雜交的誘餌蛋白載體pGBKT7-BnTR1，利用酵母雙雜交技術(shù)在甘藍(lán)型油菜葉片非生物逆境脅迫混合文庫(kù)中初步篩選得到5個(gè)BnTR1的潛在互作蛋白，包括CRT1b、CAT2和CIPK9等。
　　綜上所述，本