甘藍(lán)型油菜GRAS家族基因BLAS的分離和功能分析.pdf

1、GRAS轉(zhuǎn)錄因子作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有重要作用。但目前在油菜乃至整個(gè)蕓苔屬中對(duì)GRAS家族基因的研究還很少。擬南芥LAS基因是GRAS基因家族的成員之一,在植物的腋生分生組織的分化中具有重要地位。為深入了解甘藍(lán)型油菜中GRAS類基因的作用,本研究在克隆蕓苔屬三個(gè)種LAS同源基因的基礎(chǔ)上,通過(guò)分析過(guò)表達(dá)甘藍(lán)型油菜BnLAS基因的轉(zhuǎn)化擬南芥,對(duì)BnLAS的功能進(jìn)行了初步分析,重點(diǎn)研究了BnLAS基因在

2、提高植物抗旱性的作用,主要結(jié)果如下。
　　 利用擬南芥LAS核苷酸序列設(shè)計(jì)引物,以甘藍(lán)型油菜華雙5號(hào)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得BnLAS基因的DNA片段。通過(guò)TAIL-PCR技術(shù)分離到其兩側(cè)序列,最終獲得全長(zhǎng)為1326bp的BnLAS基因序列,同時(shí)分離到了BnLAS基因上游1944bp的啟動(dòng)子序列。生物信息學(xué)分析表明,BnLAS基因?qū)儆贕RAS家族成員,Southern雜交顯示BnLAS基因在甘藍(lán)型油菜中可能存在2個(gè)拷

3、貝。
　　 熒光定量PCR和GUS染色分析表明,BnLAS基因在植物的根部表達(dá)最強(qiáng),其次為花蕾、花、莖頂端。而在腋芽,葉片和莖中僅僅在熒光定量PCR中可以觀察到微弱的表達(dá)信號(hào)。
　　 將BnLAS基因在CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下,轉(zhuǎn)化到擬南芥植株中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)分析。結(jié)果顯示,與野生型擬南芥植株比較,過(guò)表達(dá)BnLAS對(duì)植株形態(tài)以及生長(zhǎng)發(fā)育都有明顯影響。過(guò)表達(dá)植物表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度延緩、葉綠素含量增加、花期延遲、育性降低等一系列

4、變化。
　　 將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在等生物量條件下進(jìn)行抗旱處理15天后,當(dāng)野生型植物發(fā)生萎蔫時(shí),轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)仍然較為正常。將三種類型植物(野生型植株,las突變體,過(guò)表達(dá)家系植株OL14和OL18)種植在同一缽環(huán)境條件下進(jìn)行旱脅迫處理,經(jīng)過(guò)15天處理后,過(guò)量表達(dá)植株存活率分別為71.9％(OL14)和91.6％(0L18),而野生型植株和las突變體植株的存活率分別只為21.9％和11％。離體葉片的失水速率檢測(cè)結(jié)果也表明,

5、轉(zhuǎn)基因植株的葉片離體失水速率顯著低于野生型植株。
　　 由于過(guò)表達(dá)植株的根部沒(méi)有觀察到顯著的變異,而離體葉片的失水速率減緩,暗示過(guò)表達(dá)植株抗旱性的提高可能和葉片結(jié)構(gòu)變化有著直接的關(guān)系。掃描電鏡和光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)植株OL18葉片表皮細(xì)胞減小,總氣孔數(shù)目增加1.7-1.9倍。盡管過(guò)表達(dá)植株和野生型植株間的開(kāi)放氣孔數(shù)目差異不明顯,但過(guò)表達(dá)植株的氣孔開(kāi)度只有野生型植株的18％-40％。
　　 在利用掃描電鏡觀測(cè)到轉(zhuǎn)基因

6、植株葉表面蠟質(zhì)層增厚的基礎(chǔ)上,對(duì)幾個(gè)蠟質(zhì)合成關(guān)鍵基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)進(jìn)行了熒光定量PCR分析。蠟質(zhì)合成關(guān)鍵基因CER1、CER2、KCS1、KCS2等四個(gè)基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因植株中顯著上升,表明過(guò)表達(dá)BnLAS基因影響了葉片表面的蠟質(zhì)合成。通過(guò)葉綠素浸出實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了蠟質(zhì)層的加厚導(dǎo)致了角質(zhì)層滲透性改變。
　　 綜上所述,在擬南芥中過(guò)表達(dá)BnLAS基因?qū)ζ渖L(zhǎng)發(fā)育有明顯影響,轉(zhuǎn)化植株的抗旱性明顯增加,而這種抗旱性的增加主要是