甘藍型油菜反義抑制BnTT5和BnTT8基因家族轉(zhuǎn)化后代的分析.pdf

1、甘藍型油菜(Brassicanapus)黃籽與黑籽類型相比，具有種皮薄、含油量高、蛋白質(zhì)含量高等優(yōu)點，自問世以來，一直備受廣泛關(guān)注。目前，黃籽甘藍型油菜品種極少、種質(zhì)資源有限，育種難度很大。培育遺傳簡單、性狀穩(wěn)定的黃籽甘藍型油菜是油菜育種的重要目標(biāo)之一。
　　 黃酮類化合物廣泛存在于植物中，是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，是十字花科等植物器官組織表面著色的重要成分。同時，黃酮類化合物也是公共苯丙烷途徑核心分支途徑即類黃酮途徑的主要產(chǎn)物

2、，對苯丙烷途徑終產(chǎn)物--原花青素的合成起重要作用。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，由于削弱了類黃酮途徑，導(dǎo)致種皮顏色由野生型的深褐色變成黃色或灰褐色，這種突變體稱透明種皮(transparent testa，tt)突變。目前，已鑒定出22個擬南芥透明種皮基因位點，其中大多數(shù)基因已被克隆。
　　 在擬南芥中，查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI/TT5)催化6’-羥基查爾酮轉(zhuǎn)變?yōu)?’-

3、羥基黃烷酮，是類黃酮合成途徑第二個關(guān)鍵酶，對花青素和原花青素的合成和積累起重要作用。TT8基因編碼一個bHLH型正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，它與TT2、TTG1形成一個三元復(fù)合物，調(diào)控類黃酮合成途徑的“晚期”結(jié)構(gòu)基因如DFR、BAN等的表達，從而調(diào)控原花青素、花青素苷的積累。
　　 本研究對反義BnTT5基因片段和反義BnTT8基因片段的轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜植株及其后代進行了分析，結(jié)果如下：
　　 (1)甘藍型油菜BnTT5反義轉(zhuǎn)化植株

4、的Southern雜交結(jié)果表明，外源反義BnTT5基因的構(gòu)建物已成功整合到甘藍型油菜基因組中。轉(zhuǎn)基因后代種籽粒色與對照相比有一定變淺，說明BnTT5基因確實參與決定甘藍型油菜等蕓薹屬植物的種皮色素合成。對所有反義BnTT5轉(zhuǎn)基因植株的花朵進行了觀察，并沒有發(fā)現(xiàn)與對照有什么差異，仍然是正常的金黃色，因此本研究所反義抑制的BnTT5靶基因到底與油菜花色形成有無關(guān)系或有多大關(guān)系，尚待研究。轉(zhuǎn)基因后代植株形態(tài)特征和生長情況與CK植株無明顯差異。

5、
　　 (2)甘藍型油菜BnTT8反義轉(zhuǎn)化植株的Southern雜交結(jié)果說明反義BnTT8基因成功整合到甘藍型油菜基因組中。通過半定量RT-PCR法檢測結(jié)果表明，內(nèi)源BnTT8基因的表達具有組織特異性，在轉(zhuǎn)基因的花后35 d種籽中，該基因表達受到一定程度的抑制，但抑制程度較弱而且不穩(wěn)定。GUS染色檢測呈陽性的植株收獲種籽的顏色與對照相比有明顯變淺，雖然沒有達到標(biāo)準(zhǔn)的金黃色性狀，但已比較接近黃籽。所得到的反義BnTT8轉(zhuǎn)基因后代植

6、株主體形態(tài)特征與CK植株無明顯差異，但是轉(zhuǎn)基因種子普遍飽滿度下降，粒形偏離球形，粒重由CK的3.15g下降到平均2.54g左右。這說明，BnTT8基因除了參與種皮色素合成以外，可能還參與調(diào)控了一些其它種子性狀。
　　 (3)研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株中無論是T1和T2代轉(zhuǎn)化植株的葉片GUS染色結(jié)果，還是T1代小孢子培養(yǎng)苗和T3植株的子葉和下胚軸的GUS染色鑒定結(jié)果，均是符合孟德爾遺傳規(guī)律的。轉(zhuǎn)基因后代能穩(wěn)定存活，轉(zhuǎn)入的外源基因和轉(zhuǎn)基

7、因性狀修飾亦能穩(wěn)定遺傳。
　　 (4)反義BnTT5每個獨立轉(zhuǎn)基因株系的Southern雜交顯示的外源基因雜交條帶為1-2，對應(yīng)花粉植株中多數(shù)GUS陽性和陰性的分離比均接近3∶1，T3代植株的GUS陽性/陰性分離比接近15∶1，符合孟德爾遺傳的2對獨立等位基因的分離比，表明普遍可能有2個轉(zhuǎn)基因拷貝整合到受體株的基因組中，比前面Southern雜交結(jié)果顯示的整個拷貝數(shù)偏多。但是，反義BnTT8每個獨立轉(zhuǎn)基因株系的Southern雜

8、交顯示的外源基因雜交條帶為0-1，后代GUS染色結(jié)果普遍符合一對等位基因的分離比。因此，反義BnTT8轉(zhuǎn)基因油菜后代的基本上普遍符合單拷貝整合，但反義BnTT5轉(zhuǎn)基因油菜后代普遍符合雙拷貝甚至更多拷貝插入，原因有待分析。
　　 (5)轉(zhuǎn)反義BnTT5和BnTT8基因均能抑制內(nèi)源基因的表達，但二者對靶基因的抑制程度不同。甘藍型油菜的BnTT5基因家族成員數(shù)(約8個)遠遠比BnTT8的基因家族成員數(shù)(約2個)多，且成員間的序列差異性

9、也要大得多。根據(jù)本研究的結(jié)果，對于甘藍型油菜這種多倍物種來講，反義RNA等基因沉默手段對于成員間序列高度相似的微小基因家族的抑制效果更理想，而對于成員間序列差異顯著的復(fù)雜基因家族的抑制效果則較差。此外，本研究所分析的所有轉(zhuǎn)基因后代中，內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄本和目標(biāo)性狀均有相當(dāng)程度的殘留，而且表現(xiàn)出了株間、籽粒間和環(huán)境間的變異。因此今后對于甘藍型油菜這種多倍體物種的轉(zhuǎn)基因分子育種而言，需要更為強大的基因沉默手段，才能達到更理想的抑制內(nèi)源基因家族表達