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1、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,簡稱SOD)是一種金屬酶類,它可分為四類,分別是Cu/Zn-SOD,Mn-SOD,F(xiàn)e-SOD和Ni-SOD。SOD是一種重要的氧自由基清除劑,能催化超氧陰離子(O2<,2><`>)的歧化反應(yīng)。 本文根據(jù)GenBank中所登錄的各種植物銅鋅型超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)與鐵型超氧化物歧化酶(Fe-SOD)基因的氨基酸序列及核苷酸序列,設(shè)計簡并引物,RT-PCR擴(kuò)增
2、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)兩種SOD基因中間片段。利用RACE-PCR的方法得到Cu/Zn-SOD基因的3’末端和5’末端及Fe-SOD基因的3’末端。序列拼接獲得兩種SOD(Cu/ZnSOD和Fe-SOD)基因的cDNA。將推測的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行序列同源性比較發(fā)現(xiàn),甘藍(lán)型油菜Cu/Zn-SOD與大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)的細(xì)胞質(zhì)Cu/Zn-SOD氨基酸序列同源性達(dá)
3、99%;而Fe-SOD與擬南芥(Arabidopsis thaliana)Fe-SOD3的同源性達(dá)97%。 生物信息學(xué)分析Cu/Zn-SOD基因ORF框長459bp,編碼152aa的蛋白。該蛋白分子量為15.179KD,等電點5.65,為一個酸性蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白富含延伸鏈和隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu),而且該蛋白還具有極高的親水性。另外,該蛋白含有兩個Cu/Zn-SOD信號1和2位點、一個N端糖基化位點、五個不同的N端?;稽c和一
4、個酪蛋白激酶II磷酸化位點。 生物信息學(xué)分析Fe-SOD基因ORF框長492bp,編碼163aa的蛋白。該蛋白分子量為18.899KD,等電點5.07,為一個酸性蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白富含a-螺旋和隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu),該蛋白也具有極高的親水性。另外,該蛋白含有一個Mn和Fe的SOD信號位點和一個N端?;稽c。 以中油821基因組為模板,根據(jù)全長Cu/Zn-SOD的cDNA序列設(shè)計一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到Cu/Zn-
5、SOD基因組DNA。甘藍(lán)型油菜Cu/Zn-SOD基因組DNA序列長為1322bp,登陸GenBank,序列號為DQ431853。Cu/Zn-SOD基因在基因組序列結(jié)構(gòu)上具有7個外顯子和6個內(nèi)含子。 SOD酶活測定結(jié)果表明:菌核病菌誘導(dǎo)前,抗(耐)菌核病品種的SOD活性顯著或極顯著大于感病品種的SOD酶活,其中抗(耐)菌核病品種SOD活性平均比感病品種高74.63%;菌核病菌誘導(dǎo)后,各品種SOD活性比菌核病菌誘導(dǎo)前都有所升高,其中
6、感病品種平均上升幅度為66.04%,極顯著大于抗(耐)病品種活性上升幅度。接菌葉中,寧RS-1和中R888兩個品種的SOD活性極顯著大于其它幾個品種,而中油821與感病品種植株葉片SOD活性無明顯差異。 利用擴(kuò)增的487bpCu/Zn-SOD的cDNA片段作探針,對菌核病菌誘導(dǎo)前后的不同抗(耐)、感菌核病品種mRNA進(jìn)行Northern blotting,Northern雜交的結(jié)果表明該基因片斷菌核病菌誘導(dǎo)前后在甘藍(lán)型油菜抗(耐
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