印度酸橘CrNCED3基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、柑橘是我國(guó)重要的生產(chǎn)果樹，在柑橘應(yīng)對(duì)不同環(huán)境脅迫中，ABA都起到了積極的作用。本論文以抗旱耐鹽的印度酸橘（Citrus reshni Hort. ex tan）為研究材料，利用同源序列法，克隆了脫落酸合成途徑中的限速酶(9-順環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶NCED)基因，通過(guò)半定量PCR的方法研究了不同脅迫條件（低溫4℃、干旱、鹽、外源ABA脅迫）下該基因的表達(dá)情況，結(jié)合Southern雜交確定了該基因的拷貝數(shù)；通過(guò)構(gòu)建CrNCED3基因的表達(dá)

2、載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化手段，將其轉(zhuǎn)入煙草(Nicotiana nudicaulis)中，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株在干旱條件下的表現(xiàn)進(jìn)行鑒定，初步分析了CrNCED3基因的功能。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1、克隆了印度酸橘葉片中的9-順環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（CrNCED3）開放閱讀框架，其cDNA長(zhǎng)1821bp，編碼606個(gè)氨基酸。內(nèi)含子比對(duì)證明CrNCED3沒有內(nèi)含子。多重序列比對(duì)顯示，該基因與其他物種中NCED基因高

3、度同源達(dá)60％以上。進(jìn)化分析認(rèn)為其功能可能與擬南芥AtNCED3相近。iPSORT預(yù)測(cè)表明：CrNCED3基因N-端有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。Southern雜交顯示該基因在印度酸橘中可能是單拷貝存在。
　　 2、以柑橘中的β-Actin作為內(nèi)參，對(duì)靶基因CrNCED3進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增。不同器官中的表達(dá)分析顯示，在正常生長(zhǎng)狀況下CrNCED3在根中表達(dá)量低，莖、葉中表達(dá)量高，其表達(dá)具有組織特異性。在脅迫條件下，葉片中CrNCED3能被

4、干旱和外源ABA所誘導(dǎo)，其表達(dá)量隨著處理時(shí)間的持續(xù)而增加，一旦逆境條件解除，基因表達(dá)量也隨之下降，表現(xiàn)出瞬時(shí)性的表達(dá)特點(diǎn)。4℃低溫和200mM高鹽脅迫不能誘導(dǎo)該基因使其在葉片中的表達(dá)量增加。CrNCED3在不同逆境下的表達(dá)不同，結(jié)合前人研究，說(shuō)明NCED基因家族的表達(dá)模式各不相同。
　　 3、構(gòu)建了35S::CrNCED3雙元表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化手段成功轉(zhuǎn)入煙草，經(jīng)鑒定得到了17株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。
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