小麥感白粉病候選基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、近年來，由小麥白粉病菌(Blurmeria graminisf.sp.tritici，Bgt)引起的小麥白粉病在全國發(fā)病面積廣泛，嚴重影響小麥產(chǎn)量和品質，培育抗白粉病小麥品種并運用到生產(chǎn)實際中顯得尤為重要。目前小麥抗白粉病的研究主要致力于發(fā)掘抗病基因和病程相關基因，而關于小麥感白粉病基因發(fā)掘和感病機制的報道卻很少。
　　感病基因就是病原菌誘發(fā)寄主感病的過程不可缺少的植物蛋白，包括負向調控抗病反應的感病基因和利于病原菌生長繁殖的感病

2、因子。感病基因突變引起的抗性往往具有持久性和廣譜性，如大麥mlo突變體抗大麥白粉菌幾乎所有的生理小種，該基因在生產(chǎn)上應用已超過30年，其它物種中該基因突變也可以獲得白粉病廣譜抗性。本研究利用第二代測序技術對兩組抗/感近等基因系材料進行高通量測序，發(fā)掘到14個僅在感白粉病材料中受白粉菌誘導后上調表達的感病候選基因，其中包括編碼血紅素結合蛋白的TaHBP基因、編碼具F-box保守結構域的TaFBX基因和一個編碼腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白的Ta

3、ABC基因。進一步對這三個基因進行了基因表達、進化研究和基于RNAi技術的初步功能驗證，研究結果表明這三個感病候選基因在小麥抗白粉病反應中發(fā)揮負向調控作用。
　　1.利用第二代高通量測序技術篩選感白粉病候選基因
　　本研究對抗白粉病轉基因株系Tstpk-Ⅴ/感自粉病小麥受體揚麥158和抗白粉病南農(nóng)9918/感白粉病突變體NM14兩組近等基因系材料進行白粉菌誘導處理，提取非誘導、誘導24小時的RNA樣品，利用第二代測序技術進行

4、基因表達譜測序，每個材料各獲得了超過13萬條以上的distinct tag，其中能與小麥unigene數(shù)據(jù)匹配的特異標簽各為2.6萬-3.4萬。對兩組抗感病材料的基因表達譜進行分析，從中發(fā)掘出14個僅在兩個感病材料感白粉病小麥揚麥158和感白粉病突變體NM14中受白粉菌誘導上調表達、而在2個抗病材料抗白粉病轉基因襪系Tstpk-Ⅴ和抗白粉病南農(nóng)9918中對白粉菌不應答或者受白粉菌誘導下調表達的基因，本研究將這14個基因列為感白粉病候選基

5、因(susceptibility candidate gene，SCG)。
　　2.感病相關基因的生物信息學分析
　　對14個感病基因中的三個具有推導功能的基因進行了生物信息學分析，這三個基因包括編碼血紅素結合蛋白的HBP基因TaHBP、編碼F-box蛋白的FBX基因TaFBX和一個編碼腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白的ABC基因TaABC。TaHBP基因位于小麥染色體7A短臂上，編碼保守的血紅素結合蛋白結構域(SOUL/Heme-

6、binding protein)。TaFBX位于小麥染色體5A長臂上，編碼一個Phloem protein蛋白結構域，屬于PP2超家族。TaABC位子小麥第六同源群上，蛋白質序列屬于植物的類PKc超家族。
　　3.感白粉病候選基因的表述特征分析
　　由于本研究使用的兩個抗病材料具有廣譜抗性，其中南農(nóng)9918含有Pm21基因，抗白粉病轉基因株系Tstpk-Ⅴ中的超量表達基因Stpk-Ⅴ是來自Pm21位點的關鍵基因，所以奉研究進

7、一步分析了三個感白粉病候選基因在含有Pm21基因的材料中受白粉菌誘導表達的情況。選擇了3個不同生態(tài)區(qū)的含Pm21基因的抗病材料，包括石麥14（河北石家莊）、內(nèi)麥8號（四川內(nèi)江）和蘭天17（甘肅天水），利用QRT-PCR方法分析了感白粉病候選基因在這些材料受白粉菌誘導前后的表達情況。結果顯示:TaHBP在這些材料中受誘導24小時后的表達量明顯降低;TaFBX在石麥14和內(nèi)麥8號中的表達量下降，而在蘭天17中表達量幾乎沒有變化;TaABC受

8、白粉菌誘導后的表達量在三個材料中都出現(xiàn)了明顯的下降?；虮磉_分析結果表明TaHBP和TaABC在Pm21介導的抗病反應中可能起負向調控的作用。
　　為了研究這三個基因在其他Pm基因抗性途徑中的表達模式，進一步選擇了攜帶Pm2和Pm4a的抗白粉病小麥，利用QRT-PCR方法分析它們的表達情況。結果表明:TaHBP和TaABC在這兩個材料受白粉菌誘導24小時后都出現(xiàn)明顯的下調表達;TaFBX在含Pm4a的抗白粉病小麥材料中，表達量明顯

9、降低，而在含Pm2的材料中，誘導后的表達量為誘導前表達量的80％，相比Pm4a下降幅度較小。TaHBP、TaFBX和TaABC在Pm2和Pm4a介導的白粉病抗病通路中可能也具有一定的灸向調控功能。
　　4.感白粉病候選基因的功能分析
　　為了研究TaHBP、TaFBX和TaABC三個基因在白粉病抗病途徑中的作用，本研究利用TIGS(transient induced gene silencing)瞬間表達技術和RNAi轉基因

10、技術，在單細胞水平和植株水平分別沉默三個基因，并通過葉片表皮單細胞吸器指數(shù)的統(tǒng)計和轉基因植株的抗病性鑒定，對三個基因進行初步的功能分析。研究結果表明:揚麥158葉片單細胞水平上沉默這三個基因都可使白粉菌的吸器指數(shù)下降，其中沉默TaHBP后吸器指數(shù)由51.1％降為40.2％，沉默TaFBX后吸器指數(shù)由51.8％降至43.8％，沉默TaABC后吸器指數(shù)由52.4％降至43.5％。
　　進一步將三個基因的RNAi載體導入受體揚麥158中

11、，創(chuàng)造基因沉默的轉基因植株。對TaFBX的RNAi T0代植株進行苗期離體鑒定，發(fā)現(xiàn)3棵抗性提高的植株，通過T1代苗期和成株期抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，這三個株系出現(xiàn)抗感分離，PCR擴增和基因表達分析結果顯示，TaFBX沉默的陽性植株，抗性都得到了提高，說明TaFBX參與到抗白粉病過程中，并且起負向調控的作用。在TaABC的RNAi T1代的鑒定中出現(xiàn)四個抗感分離的株系，這些株系對應的T0代植株也有較高的抗病性，PCR鑒定結果顯示，成功導入RNAi

12、載體的T1代植株抗病性得到提高，說明TaABC參與到抗白粉病途徑中，并且發(fā)揮負向調控作用。TaHBP的RNAi T0代植株有218株，對其中種植在田間的48棵轉基因植株進行了PCR鑒定獲得3棵陽性植株，基因沉默植株的抗病性是否有變化有待用T1代陽性轉基因植株進行抗病性鑒定。
　　綜上所述，選擇抗感材料近等基因系進行高通量測序是篩選感病基因的一種可行手段，其遺傳背景的高度一致性可提高感病基因篩選效率;獲得感白粉病候選基因后，利用RN