油桐異質(zhì)型ACCase基因的克隆及功能表達(dá)研究.pdf

1、油桐，作為中國的獨有經(jīng)濟(jì)林木，與烏桕、核桃、油茶共稱為我國的四大木本油料植物。桐油富含桐酸等不飽和脂肪酸，具有光澤度好、不導(dǎo)電性、不透水性、抗酸堿、耐銹蝕、耐腐蝕、耐熱等特質(zhì)，蘊(yùn)含著非常高的經(jīng)濟(jì)價值，是重要的工業(yè)原料，被廣泛用于合成涂料和油漆。在植物油脂合成途徑中，乙酰輔酶A羧化酶催化反應(yīng)不光是首個步驟，也是關(guān)鍵步驟，更是限速步驟，因此，研究油桐乙酰輔酶A羧化酶基因?qū)沂居屯┯椭铣傻囊?guī)律和油桐分了育種方面有重大意義。本研究主要在油桐乙

2、酰輔酶A羧化酶基因的分離克隆以及其在油桐組織中的表達(dá)方面開展研究，主要的研究結(jié)果如下:
　　1、油桐ACCase4個亞基基因的cDNA克隆及生物信息學(xué)分析。以本實驗室的對年桐為材料，根據(jù)油桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別設(shè)計引物，采用RT-PCR技術(shù)克隆出了油桐ACCase4個亞基基因的cDNA全長序列。其中，生物素羧化酶基因cDNA全長為1605bp，ORF為1605bp，編碼534個氨基酸，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)分子量為58262.0Da，等電點pI

3、為7.98，GenBank登錄號為KF964573;生物素羧基載體蛋白基因cDNA全長為813bp，ORF為813bp，編碼270個氨基酸，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)分子量為26496.6Da，等電點pI為5.76，GenBank登錄號為JQ736807;α-羧基轉(zhuǎn)移酶基因cDNA全長為2313bp，ORF為2313bp，編碼770個氨基酸，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)分子量為85902.7 Da，等電點pI為8.48，GenBank登錄號為KF964574;β-羧

4、基轉(zhuǎn)移酶基因cDNA全長為1506bp，ORF為1506bp，編碼501個氨基酸，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)分子量為56688.1Da，等電點pI為4.92。
　　2、油桐ACCase4個亞基基因的基因組克隆。以本實驗室的對年桐為材料，提取DNA，分別設(shè)計引物，采用RT-PCR技術(shù)，克隆出了4個亞基基因組序列。其中，accC和accD基因經(jīng)克隆、測序檢測，不含有內(nèi)含子。accB基因的基因組全長2157bp，含有5個內(nèi)含子，位置為128-845b

5、p、1001-1100bp、1419-1577bp、1648-1841bp、1907-1991bp。accA基因的基因組全長為4995bp，含有9個內(nèi)含子，位置為328-425bp、501-1465bp、1574-1728bp、1888-1998bp、2116-2199bp、2355-2017b、3070-3148bp、3218-3577bp、3656-3821bp。
　　3、油桐ACCase基因在種子發(fā)育的不同時期及樹體的不同組

6、織的表達(dá)。運用實時熒光定量技術(shù)分析出ACCase4個亞基基因在種子發(fā)育的不同時期及樹體的不同組織的相對表達(dá)量。在種子的發(fā)育過程中，4個亞基基因都出現(xiàn)了兩個轉(zhuǎn)錄高峰，分別為花后145天和花后205天。在樹體不同器官組織中，accC基因在花瓣和雌蕊中轉(zhuǎn)錄量最高;accB基因在花瓣、雌蕊和萼片中轉(zhuǎn)錄量最高;accA基因在花瓣、雌蕊和雄蕊中轉(zhuǎn)錄量最高;accD基因在幼葉中轉(zhuǎn)錄量最高。
　　4、油桐ACCase4個亞基基因的真核表達(dá)。成功構(gòu)

7、建了植物超表達(dá)載體pCAMBIA1304-35S-accA、 pCAMBIA1304-35S-accB、pCAMBIA1304-35S-accC、pCAMBIA1304-35S-accD，利用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101中。(1)通過葉盤法侵染野生型的煙草，并篩選陽性植株。以篩選的抗性植株總DNA為模板，以未轉(zhuǎn)化的植株為陰性對照，以構(gòu)建好的超表達(dá)載體為陽性對照，利用超表達(dá)載體中GUS序列設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，通過