靈芝羥甲基戊二酰輔酶A合酶基因的克隆及其表達和功能特性的研究.pdf

1、靈芝三萜類化合物是靈芝的重要藥用成分，具有多種重要的生理功能，靈芝中三萜含量的高低已經(jīng)成為靈芝質(zhì)量高低的重要指標(biāo)。靈芝羥甲基戊二酰輔酶A合酶基因（GlHMGS）作為甲羥戊酸途徑中的第一個催化酶，催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA，對于靈芝三萜的合成起著十分重要的作用。
　　 根據(jù)已發(fā)表的其它物種HMGS氨基酸序列的保守區(qū)，設(shè)計簡并引物，以靈芝基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄的原基cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增，獲得了兩個大小

2、分別為600、350bp的靈芝羥甲基戊二酰輔酶A合酶基因特異的DNA和cDNA片段。利用獲得的G1HMGS基因特異片段，根據(jù)SEFA-PCR的原理，設(shè)計特異性引物，以靈芝基因組DNA為模板擴增得到G1HMGS基因的5’端序列；以靈芝原基cDNA作為模板，通過3’RACE技術(shù)獲得G1HMGS基因的3’端cDNA序列；進而根據(jù)獲得的5’端和3’端序列信息設(shè)計引物，分別以靈芝總基因組DNA和原基cDNA為模板，得到G1HMGS基因的全長DNA

3、和cDNA序列。
　　 結(jié)果表明：該基因DNA全長為1870 bp，其中ORF為1413 bp，編碼471個氨基酸，推測的分子量為51.14 kDa。通過比對獲得的DNA和cDNA序列，發(fā)現(xiàn)GlHMGS由5個外顯子和4個內(nèi)含子構(gòu)成；與NCBI數(shù)據(jù)庫中HMGS的蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，G1HMGS與解脂耶羅威亞酵母的HMGS表現(xiàn)出最高的同源性（51％）。進化樹分析也表明G1HMGS與真菌親緣關(guān)系最近，符合靈芝的物種分類地位。將獲得的G1

4、HMGS基因轉(zhuǎn)入HMGS缺陷的二倍體釀酒酵母菌株YSC1021，經(jīng)產(chǎn)孢培養(yǎng)和單倍體篩選獲得HMGS缺陷的單倍體轉(zhuǎn)化子，發(fā)現(xiàn)在有G1HMGS表達的單倍體酵母轉(zhuǎn)化子中，其HMGS缺陷的表型可以得到互補，從而證實了所得GlHMGS的功能。
　　 另外，根據(jù)G1HMGS基因DNA序列設(shè)計引物，以靈芝基因組DNA為模板，利用SEFA-PCR技術(shù)擴增G1HMGS基因上游啟動子序列，該序列長約1561 bp，用Softberry等軟件對啟動子

5、序列進行分析，發(fā)現(xiàn)G1HMGS基因啟動子中包含有明顯的TATA-box和CAAT-box，并發(fā)現(xiàn)了多個與甾醇、激素和環(huán)境壓力等調(diào)節(jié)相關(guān)的順式作用元件。
　　 同時，利用Real Time RT-PCR技術(shù)，檢測了靈芝不同發(fā)育階段中GIHMGS在mRNA水平的表達差異。結(jié)果證明，GlHMGS mRNA的轉(zhuǎn)錄水平以靈芝發(fā)育初期的菌絲體階段最高，而在三萜含量最高的原基時期很低，說明GlHMGS可能同時受到了發(fā)育調(diào)節(jié)和甾醇的反饋抑制。對

6、茉莉酸甲酯誘導(dǎo)條件下GlHMGS mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測也發(fā)現(xiàn)：茉莉酸甲酯對GlHMGS的影響十分明顯。其中以茉莉酸甲酯作用濃度為100μM處理5天時對GlHMGS的誘導(dǎo)效果最顯著；同時，對GlHMGS啟動子的分析發(fā)現(xiàn)其上存在潛在的茉莉酸甲酯響應(yīng)元件.這些結(jié)果表明，GlHMGS可能同時受多種生理途徑的綜合調(diào)節(jié)，并在靈芝三萜生物合成途徑中起著重要的作用.
　　 本實驗還研究了靈芝漆酶的同工酶基因Laccase受金屬cu2+誘導(dǎo)表達