靈芝法呢基焦磷酸合酶基因的克隆和表達特性研究.pdf

1、靈芝(Ganoderma lucidum)在我國已有悠久的應用歷史，可用于多種疾病的治療。三萜類化合物是靈芝的重要藥用成分，具有保肝、抗腫瘤、抑制組織胺釋放、抑制膽固醇的合成和吸收以及抗HIV和抗HIV蛋白酶的作用等功能。因此，靈芝中三萜含量的高低已經成為靈芝藥效高低的重要指標。 作為次生代謝產物，三萜類化合物是通過甲羥戊酸途徑，由法呢酯焦磷酸產生鯊烯、再轉化成2，3-氧化鯊烯，最后經過一系列的氧化、還原和環(huán)化反應形成的。法呢基

2、焦磷酸合酶(FPS)處于甲羥戊酸途徑中的第一個分支點，是類異戊二烯生物合成過程中的一個關鍵酶，它可以催化兩分子異戊烯基焦磷酸與二甲基烯丙基焦磷酸的相繼性頭尾縮合，形成法呢基焦磷酸(FPP)。FPS的含量與活性高低會影響三萜化合物產量的多少。 根據已發(fā)表的其它物種FPS氨基酸序列的保守區(qū)，設計簡并引物，以靈芝cDNA文庫為模板，經PCR擴增，獲得了一個456 bp的靈芝法呢基焦磷酸合酶基因特異cDNA片段。利用獲得的靈芝法呢基焦磷

3、酸合酶基因特異片段，設計特異性引物，結合cDNA文庫的通用引物，擴增得到靈芝FPS基因的5'端cDNA片段。提取靈芝原基時期的RNA，經反轉錄后的cDNA作為模板，通過3'RACE，獲得靈芝FPS基因的3'端cDNA片段。根據擴增獲得的序列信息設計引物，以反轉錄的原基cDNA為模板，得到靈芝FPS基因的全長cDNA序列，該序列全長為1083 bp，編碼360個氨基酸殘基。其推導的蛋白分子量為42.27kDa。 根據靈芝FPS基因

4、全長cDNA序列設計引物，擴增靈芝的基因組DNA，得到靈芝FPS基因的全長基因組序列，該序列全長為1388 bp，F(xiàn)PS基因由4個外顯子和3個內含子構成。 靈芝FPS蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，靈芝FPS與另一種擔子菌黃汁乳菇的FPS表現(xiàn)出最高的相似性(59％)，并且包含有不同物種FPS序列中的四個保守區(qū)。在FPS的分型中，靈芝FPS屬于I型(真核狀態(tài))法呢基焦磷酸合酶，這與靈芝的物種分類相吻合。 將靈芝FPS基因全長cDNA序列

5、克隆到酵母表達載體pYF1845中，轉入因缺失FPS活性而依賴麥角甾醇的酵母突變株CC25。結果轉化子可以在36℃、不含麥角甾醇的培養(yǎng)基平板上生長，證實了所獲得FPS基因cDNA序列的功能。 根據靈芝FPS基因DNA序列設計引物，以靈芝基因組DNA為模板，擴增FPS基因上游啟動子序列，該序列長約1288 bp，用Softberry軟件對啟動子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)靈芝FPS基因啟動子中包含有明顯的TATA-box和CAAT-box，

6、并發(fā)現(xiàn)了多個與固醇、激素和環(huán)境壓力等調節(jié)相關的順式作用元件。 通過競爭性RT-PCR的方法，檢測了不同發(fā)育階段靈芝中FPS在mRNA水平的表達差異。結果證明，在靈芝原基中，F(xiàn)PS mRNA的轉錄水平要明顯高于菌絲體中的轉錄水平。這種差異與Hirotani等所報道三萜含量的變化呈正相關。 在培養(yǎng)基中添加植物激素茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)，對靈芝三萜的生物合成有很好的誘導效果。基于此，對由不同濃