α-半乳糖苷酶基因及酸性磷酸酶基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase，EC 3.2.1.22)是催化α-半乳糖苷鍵水解的酶類(lèi)，廣泛的分布于植物、動(dòng)物和微生物體內(nèi)。它不但可以催化α-半乳糖苷類(lèi)的寡糖，還可以催化含α-半乳糖苷鍵的多聚糖。該酶在飼料、食品、造紙和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。然而目前α-半乳糖苷酶主要是從原始菌株中分離得到，產(chǎn)量較低，成本較高，利用微生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和手段，克隆α-半乳糖苷酶基因，構(gòu)建高效表達(dá)和分泌的基因工程菌

2、株來(lái)提高α-半乳糖苷酶產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本是解決這一問(wèn)題的有效途徑。 從我國(guó)長(zhǎng)江中下游的地?zé)崦旱V中分離得到一株屬于地?zé)嵫挎邨U菌的新菌株。根據(jù)同屬的全基因組序列分析，從中克隆了推定的α-半乳糖苷酶基因α-gal-g。該基因全長(zhǎng)2190bp，編碼729個(gè)氨基酸，理論分子量為83.5 kD，理論等電點(diǎn)為6.595。 將α-gal-g基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9中，電擊轉(zhuǎn)化宿主菌GS115，從100個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選到了13株

3、表達(dá)α-半乳糖苷酶的重組子，其中92<'＃>轉(zhuǎn)化子在3 L發(fā)酵罐水平α-半乳糖苷酶的酶活力達(dá)80U/ml以上。 從高溫塘泥(溫度在40～85℃之間)中分離到一組嗜熱微生物，提取環(huán)境基因組DNA，通過(guò)隨機(jī)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)許多基因與Thermus屬的DNA相似性很高，根據(jù)GenBank上Thermus thermophilus HB8基因組序列中推定的酸性磷酸酶基因(TTHA1616)，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到一段798 bp的DNA序列