25014.轉(zhuǎn)糖基活性β半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株篩選、克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明1930_『13本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含本人為獲得江南大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。簽名：姿茬龔日期幽僻月『7日關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本學(xué)位論文作者完全了解江南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文

2、的規(guī)定：江南大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。簽名：觸導(dǎo)師簽名：1墮翌墮日期渺。。年(，月‘7El摘要摘要p半乳糖苷酶(EC32123)俗稱乳糖酶，不僅能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖，而且具有轉(zhuǎn)糖基活性，是

3、一種重要的糖苷水解酶，在食品、醫(yī)藥和分析化學(xué)等領(lǐng)域都有重要應(yīng)用。近年來(lái)隨著糖生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)糖基p半乳糖苷酶逐漸成為糖類合成的重要工具酶，被用于合成各種糖基化合物，乳果糖、低聚半乳糖就是其中比較突出的兩種。本課題旨在從自然界篩選得到一株水解活力較高、兼具轉(zhuǎn)糖基活性、生長(zhǎng)發(fā)育良好的p半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，緊接著從基因克隆、基因表達(dá)、重組菌誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化、重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究以及酶法合成低聚糖等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究，進(jìn)而為其在功

4、能性低聚糖生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用打下一定基礎(chǔ)。通過(guò)四級(jí)篩選，從自然界中得到一株水解活力相對(duì)較高、兼具轉(zhuǎn)糖基活性、生長(zhǎng)發(fā)育良好的B半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株，借助菌落形態(tài)觀察、生化指標(biāo)測(cè)定以及16SrDNA序列分析，鑒定其為Klebsiellapneumoniae285。通過(guò)單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)Klebsiellapneumoniae285產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基組成為乳糖50∥L，蛋白胨20∥L，酵母浸膏109／L，氯化鈉3eCt；最優(yōu)發(fā)酵條

5、件為種齡6h，起始pH70，接種量3％，裝液量40mL／250mL，30℃下發(fā)酵8h。最優(yōu)條件下產(chǎn)酶活力為721U／mL。以乳糖為底物Klebsiellapneumoniae285B半乳糖苷酶催化生成低聚糖，反應(yīng)液組分包括果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、低聚糖(包括轉(zhuǎn)移二糖、低聚三糖)。反應(yīng)液總糖中，葡萄糖占97％，乳糖占269％，低聚糖占537％。以乳糖、果糖為底物時(shí)，反應(yīng)液總糖中，果糖占214％，葡萄糖占51％，乳糖占234％，低聚糖占

6、450％。PCR擴(kuò)增Klebsiellapneumoniae285B一半乳糖苷酶編碼基因，構(gòu)建DH50／pMDl8TbgaB以及DH50／pMDl8一TLacZ兩株克隆菌株，委托測(cè)序，結(jié)果表明兩段序列與已報(bào)道的不同亞種對(duì)應(yīng)序列的同源性均極高。成功構(gòu)建BL21／pET28a()bgaB以及BL21／pET28a()LacZ兩株表達(dá)菌株，同時(shí)實(shí)現(xiàn)酶活表達(dá)。通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)兩株重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果得到BL21／pET28a()b

7、gaB重組菌的最佳誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)135min、IPTG濃度02mmol／L、誘導(dǎo)長(zhǎng)度8h；BL21／pET28a()LacZ重組菌的最佳誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)120min、IPTG濃度06mmol／L、誘導(dǎo)長(zhǎng)度9h。用金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠層析柱分離純化帶(His)6標(biāo)簽的重組酶，得到兩種重組酶的最適咪唑洗脫濃度均為350mmol／L，電泳檢測(cè)均獲得單一條帶。純化后bgaB重組B半乳糖苷酶的比酶活為18545U／rag，是純化前比酶活的9