重要海水養(yǎng)殖魚類MHCⅡ基因克隆、表達及多態(tài)性分析.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ基因是一種編碼細胞表面糖蛋白的異二聚體,是高度多態(tài)的基因,且其某些基因型與生物體抗病力存在一定的相關(guān)關(guān)系。本研究以我國重要海水經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類真鯛、大菱鲆和牙鲆為實驗材料,利用PCR、RT-PCR、RACE、Southem blot等技術(shù)研究了MHCⅡ基因的克隆、表達、等位基因的多態(tài)性以及等位基因的多態(tài)性與魚體抗病力之間的關(guān)系,為篩選抗病相關(guān)M

2、HC Ⅱ B基因標(biāo)記,建立基因標(biāo)記輔助選育技術(shù)提供基礎(chǔ)。 (1)根據(jù)本實驗室建立的真鯛cDNA文庫中EST序列測序,得到全長為1191bp的MHC Ⅱ BcDNA序列(Genbank accession NO.:AY848956),經(jīng)BLAST分析為MHC Ⅱ B基因。和其它脊椎動物的全長基因組序列比較,設(shè)計特異性引物進行內(nèi)含子的PCR擴增,得到2494bp的基因組全序列。以rsbMHC2bln1N和rsbMHC2bIn4C為引

3、物進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物包括完整開放閱讀框序列,有7個真鯛個體被用于分析真鯛MHC ⅡB的多態(tài)性,結(jié)果得到6個不同的等位基因。為了研究真鯛MHC Ⅱ B的位點數(shù)量,用同一對引物對同一真鯛個體的開放閱讀框的cDNA序列進行了PCR擴增。在所測序的11個不同的陽性克隆中,有4個不同的cDNA序列被鑒定出。另外,利用rsbMHC2b3'IJTRN和rsbMHC2b3'LITRC為引物,擴增同一真鯛個體的3'UTR,有12個陽性克隆被測序,測

4、序結(jié)果中有2個不同的序列被鑒定出,表明MHCⅡB基因至少存在兩種不同的位點。用Southernblot方法進一步驗證真鯛MHCⅡB基因的位點數(shù)。用MEGA3.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn)真鯛MHCⅡB基因的7種不同的序列聚類到一簇,另外與鱸魚的親緣關(guān)系較近,與麗魚、虹鱒、大西洋鮭的親緣關(guān)系次之,與小鼠和人類的最遠。以正常魚和鰻弧菌感染后真鯛組織為材料,以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板,應(yīng)用RT-PCR半定量檢測方法對大菱鲆的MHC Ⅱ

5、B基因組織表達特點進行了研究,結(jié)果表明,在正常真鯛組織中,其中較強的表達于鰓、脾、頭腎、腎、胃、小腸和心臟中,在肌肉和血中表達最弱。在鰻弧菌感染后的肝臟、脾臟、小腸和頭腎組織中,卡方檢驗表明,MHCIIB基因表現(xiàn)為具有極顯著差異的表達(X<'2>=103.79,248.19,19.44和87.38,P<0.01)。 伴隨全球海洋漁業(yè)資源全面衰退和生態(tài)系統(tǒng)的不斷退化，海洋漁業(yè)資源的管理理念正在發(fā)生深刻變化；以海洋生態(tài)系統(tǒng)動力學(xué)研究

6、為基礎(chǔ)的生態(tài)系統(tǒng)水平上的漁業(yè)資源管理已成為一種必然的發(fā)展趨勢。 鳀魚(Engraulis iaponicus)是黃海生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵種。20世紀80年代中后期鳀魚資源尚未大規(guī)模開發(fā)之時的資源量在300萬噸的水平上波動；90年代后期隨著漁業(yè)產(chǎn)量的迅猛發(fā)展，鳀魚資源大幅衰退，至2003年越冬群體資源降至僅有10萬噸，資源已近崩潰邊緣。 本文在我國海洋生態(tài)系統(tǒng)動力學(xué)研究的框架下，利用近年在魚類資源和魚類群體結(jié)構(gòu)聲學(xué)一拖網(wǎng)評估方法

7、方面的研究成果和1985年以來黃海鯤魚資源的聲學(xué)評估調(diào)查資料，對黃海鳀魚群體的群體結(jié)構(gòu)、親體一補充關(guān)系以及鳀魚群體的可持續(xù)產(chǎn)出等種群動力學(xué)特征進行了評估與分析，并對其資源可持續(xù)利用問題進行了探討，以期為鳀魚種群對人類活動和自然變化的響應(yīng)機制研究提供依據(jù)，為實現(xiàn)生態(tài)系統(tǒng)水平上的鯉魚資源管理提供基礎(chǔ)資料。主要結(jié)果如下。 1. 建立了利用聲學(xué)數(shù)據(jù)和不定點拖網(wǎng)數(shù)據(jù)評估鯤魚體長結(jié)構(gòu)和年齡結(jié)構(gòu)的方法，并利用該方法對1999年來的鯤魚群體結(jié)

8、構(gòu)進行了評估。通過對越冬群體和生殖群體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，黃海鳀魚群體已呈現(xiàn)明顯的小型化、低齡化趨勢，主要表現(xiàn)在平均體長的減小和平均年齡的降低，分別由1992年的11.6cm和1.7齡降為2004年的10.1cm和1.4齡：體長分布由單峰型變?yōu)殡p峰型，1齡補充群體所占比重越來越大。但大個體、高齡魚尚未從群體中完全消失，最大體長1 7cm和最大年齡4齡的群體結(jié)構(gòu)仍在；這對黃海鳀魚資源的恢復(fù)具有重要意義。 2.分別采用VPA、最小二

9、乘法和迭代逼近法對黃海鳀魚的自然死亡系數(shù)、補充量、繁殖率和親體一補充關(guān)系進行了評估。結(jié)果表明，20世紀90年代后期和MHC ⅡB基因和其它已知的生物的MHCⅡ基因的序列比較和進化樹分析。同時利用RT-PCR方法進行了牙鲆MIHC Ⅱ基因在正常組織、不同發(fā)育階段的胚胎、鰻弧菌感染后得組織中的表達分析。利用1對特異引物分別對42尾抗病牙鲆和42尾感病牙鲆進行了包括部分外顯子1、完整的內(nèi)含子1和大部分外顯子2序列的PCR擴增。從811個陽性克

10、隆的測序結(jié)果中，得到13種不同的核苷酸序列，分別編碼13種不同的氨基酸序列。經(jīng)卡方檢驗13種基因型在兩種群體中的出現(xiàn)頻率，其中大部分基因型于兩種群體中同時存在；基因型g和h只出現(xiàn)于抗病群體中；基因型1只出現(xiàn)在感病群體中。對核苷酸替換類型和位點進行分析，結(jié)果發(fā)生在多肽結(jié)合位點的非同義堿基替換(dN)與同義堿基替換率(dS)的比值遠遠大于非多肽結(jié)合位點的dN／dS，說明核苷酸替換主要發(fā)生在exorn2的多肽結(jié)合位點(Protein bind