三種海水魚類MHC基因多態(tài)性及半滑舌鰨家系構(gòu)建與選育.pdf

1、本研究中，我們用一個(gè)感染性很強(qiáng)的細(xì)菌感染大菱鲆(Scophthalmusmaximus)，來(lái)研究它的主要組織相溶性復(fù)合體(MHC)ⅡB類基因的遺傳變異情況。從6個(gè)大菱鲆家系中每個(gè)家系取100尾魚苗用來(lái)注射愛德華氏菌懸液，家系的死亡率范圍為28％到83.33％。每個(gè)家系選取5個(gè)存活個(gè)體和5個(gè)死亡個(gè)體，利用克隆和直接測(cè)序的方法來(lái)擴(kuò)增大菱鲆MHCⅡB基因的第二外顯子和第一內(nèi)含子。從60個(gè)體中獲得37個(gè)序列代表37個(gè)等位基因，其中25個(gè)等位基因

2、是本研究中第一次發(fā)現(xiàn)，25個(gè)等位基因?qū)儆?6個(gè)等位基因主型，選擇8個(gè)等位基因來(lái)進(jìn)行等位基因與抗病性/易感性間的關(guān)聯(lián)性研究。在研究的每一個(gè)體中存在5個(gè)等位基因表明在大菱鲆中至少存在有3個(gè)位點(diǎn)或者拷貝的MHCⅡB基因。在全部家系數(shù)據(jù)中多肽結(jié)合區(qū)的非同義替換率是同義替換率的2.298倍，而在非多肽結(jié)合區(qū)非同義替換率是同義替換率的1.58倍，這些研究結(jié)果表明平衡選擇在大菱鲆MHCⅡB基因的第二外顯子中起作用。Scma-DBB1*02等位基因在存

3、活個(gè)體中出現(xiàn)的頻率要顯著高于死亡個(gè)體中出現(xiàn)的頻率(P=0.001＜0.05)，表明這個(gè)等位基因與大菱鲆抗愛德華氏菌病有關(guān);而Scma-DBB1*10等位基因在死亡個(gè)體中出現(xiàn)的頻率要顯著高于存活個(gè)體中出現(xiàn)的頻率(P=0.021＜0.05)，表明這個(gè)等位基因與大菱鲆對(duì)愛德華氏菌敏感相關(guān)。
　　在脊椎動(dòng)物細(xì)胞表面糖蛋白的Ⅰ類和Ⅱ類分子上的MHC基因以高水平的多態(tài)性著稱。先前的研究發(fā)現(xiàn)，在牙鲆(Paralichthys olivaceus

4、)中Paol-DAB*4301等位基因與抗鰻弧菌病相關(guān)，并且在牙鲆G1代中抗病家系0768和0751中出現(xiàn)的頻率很高。為了研究Paol-DAB*4301等位基因在牙鲆后代個(gè)體中的遺傳變異情況，利用鰻弧菌液對(duì)7個(gè)牙鲆家系的700個(gè)體進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在這些家系中有不同的死亡率。從7個(gè)牙鲆家系的每個(gè)家系中各選取5-10個(gè)存活及死亡個(gè)體通過(guò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和直接測(cè)序的方法來(lái)研究它們的MHCⅡB類基因的外顯子2序列。發(fā)現(xiàn)116個(gè)不同的外

5、顯子2序列并且代表116個(gè)不同的等位基因，顯示出在牙鲆的MHCⅡB類基因的外顯子2至少存在4個(gè)位點(diǎn)。14個(gè)等位基因在同一個(gè)家系中的存活個(gè)體和死亡個(gè)體出現(xiàn)的頻率不同但不具有顯著性。在MHC基因的多肽結(jié)合區(qū)(PBR)的非同義替換與同義替換的(dN/dS)比率是6.234，表明平衡選擇在MHCⅡB類基因中起作用。Paol-DAB*4301等位基因在家系101、家系104、家系92、家系102中都出現(xiàn)，而另一個(gè)等位基因Paol-DAB*0101

6、也在家系101、家系104、家系41、家系102中出現(xiàn)。家系5是在G2代中最抗病的家系并且在MHCⅡB基因上具有最低的雜合度。在家系101中，等位基因Paol-DAB*4301在存活個(gè)體中出現(xiàn)的頻率是11.2％而在死亡個(gè)體中出現(xiàn)的頻率是4.8％并且兩個(gè)頻率間具有顯著性差異(p=0.001＜0.05);在家系104中，等位基因Paol-DAB*4601在本研究中首次發(fā)現(xiàn)并且在存活個(gè)體中出現(xiàn)的頻率(13.6％)要顯著高于在死亡個(gè)體中出現(xiàn)的頻

7、率(6.5％，p=0.001);在家系41中，等位基因Paol-DAB*3803在存活個(gè)體中出現(xiàn)的頻率(26％)要顯著高于死亡個(gè)體中的頻率(8％、p=0.01)。研究結(jié)果表明Paol-DAB*4301、Paol-DAB*4601、Paol-DAB*4302、Paol-DAB*3803、Paol-DAB*4101等位基因與牙鲆抗鰻弧菌病相關(guān)而Paol-DAB*2201、Paol-DAB*0301等位基因與牙鲆易感鰻弧菌病相關(guān)。
　　

8、利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和直接測(cè)序的方法對(duì)10個(gè)半滑舌鰨家系中MHC基因位點(diǎn)遺傳變異和平衡選擇情況進(jìn)行了研究。通過(guò)PCR方法擴(kuò)增了半滑舌鰨MHCⅡB基因大約397 bp片段，這部分包含第一外顯子的一部分，第一內(nèi)含子的全部和第二外顯子的全部。在10個(gè)半滑舌鰨家系中，每個(gè)家系中選取5個(gè)個(gè)體，每個(gè)體中選取5個(gè)克隆進(jìn)行MHCⅡB基因序列分析。在50個(gè)體中發(fā)現(xiàn)60個(gè)不同序列代表60個(gè)等位基因，其中有28個(gè)序列是新發(fā)現(xiàn)的并遞交到GenBank。

9、同源分析表明60個(gè)序列相似性為89.36％。在6個(gè)個(gè)體中每個(gè)體發(fā)現(xiàn)有5個(gè)不同的序列，表明在半滑舌鰨個(gè)體中至少存在3個(gè)位點(diǎn)或者拷貝;在9個(gè)家系的個(gè)體中MHCⅡB序列多肽結(jié)合區(qū)(PBR)的錯(cuò)義替換(dN)顯著高于同義替換(dS)。
　　組織相容性復(fù)合體(MHC)基因產(chǎn)物參與呈遞外源多肽給T細(xì)胞從而在先天性免疫和適應(yīng)性免疫中具有重要的作用。我們研究了經(jīng)過(guò)鰻弧菌感染后的半滑舌鰨MHC classⅡB基因的遺傳變異情況。來(lái)自于12個(gè)半滑舌鰨

10、家系的2400尾魚苗用來(lái)進(jìn)行鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染。為了研究等位基因和抗性/易感愛德華氏菌病間的相關(guān)性，從4個(gè)抗病家系(HR，＜40.55％死亡率)和易感家系(LR，＞73.27％死亡率)中選出160尾個(gè)體進(jìn)行MHCⅡB基因的exon2序列分析。半滑舌鰨MHCⅡB基因的exon2序列間顯示出高度的多態(tài)性并且發(fā)現(xiàn)至少存在有4個(gè)位點(diǎn)。同時(shí)，多肽結(jié)合區(qū)的dN/dS值（非同義替換與同義替換的比值）要高于非多肽結(jié)合區(qū)的

11、dN/dS值。在160個(gè)體中發(fā)現(xiàn)有88個(gè)等位基因，其中的13個(gè)等位基因用于抗病家系和易感家系中進(jìn)行分布模式分析。特定的等位基因在抗病家系和易感家系中出現(xiàn)的頻率是不同的，或者是只在抗病家系或者只在易感家系中出現(xiàn)。5個(gè)等位基因Cyse-DBB*6501、Cyse-DBB*4002、Cyse-DBB*6102、Cyse-DBB*5601和 Cyse-DBB*2801發(fā)現(xiàn)與半滑舌鰨易感鰻弧菌病相關(guān)并且在抗病家系中出現(xiàn)的頻率分別為1.25％、1.

12、25％、1.25％、1.25％和2.5％，在易感家系中出現(xiàn)的頻率分別為35％、33.75％、27.5％、16.25％、15％(p=0.000、0.000、0.000、0.001、0.009)。4個(gè)等位基因Cyse-DBB*3301、Cyse-DBB*4701、Cyse-DBB*6801和Cyse-DBB*5901發(fā)現(xiàn)與半滑舌鰨抗鰻弧菌病相關(guān)，這4個(gè)等位基因在抗病家系中出現(xiàn)的頻率分別為13.75％、11.25％、11.25％、8.75％并

13、且在易感家系中出現(xiàn)的頻率分別為1.25％、1.25％、1.25％、1.25％和1.25％(p=0.005、0.018、0.018和0.064)。本研究闡明MHCⅡB基因的作用將有助于半滑舌鰨分子標(biāo)記輔助選擇育種的深入發(fā)展。
　　以半滑舌鰨渤海野生群體和人工養(yǎng)殖群體為基礎(chǔ)群體，建立了半滑舌鰨家系18個(gè)。對(duì)不同家系魚苗進(jìn)行熒光標(biāo)記后放在同池進(jìn)行生長(zhǎng)比較，表明不同家系魚苗生長(zhǎng)速度差異顯著，篩選出生長(zhǎng)快速的家系2個(gè)（家系15和16號(hào)），生

14、長(zhǎng)較快的家系4個(gè)（家系6號(hào)、7號(hào)、16號(hào)和30號(hào)），生長(zhǎng)速度一般的家系12個(gè)（家系1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、10號(hào)、12號(hào)、14號(hào)、19號(hào)、24號(hào)、27號(hào)、28號(hào)、33號(hào)和34號(hào)）。利用鰻弧菌感染其中12個(gè)家系，結(jié)果顯示，2號(hào)家系感染后的成活率為79.25±45.19，被認(rèn)作抗病力強(qiáng)家系;2個(gè)家系（12號(hào)和14號(hào)）感染后的成活率為50％-60％，被認(rèn)作抗病力較強(qiáng)家系;6個(gè)家系（3號(hào)，6號(hào)，7號(hào)，10號(hào)，16號(hào)和19號(hào)）成活率為35％-50％，被