幾種海水魚(yú)類種質(zhì)超低溫冷凍保存研究.pdf

1、自20世紀(jì)50年代，Blaxter首次成功冰凍保存了太平洋鯡魚(yú)(Clupea harengus)精巢后，到目前為止，種質(zhì)資源的超低溫冷凍保存技術(shù)已經(jīng)取得了不錯(cuò)的成績(jī)，并正日益趨于成熟。目前，已對(duì)200多種淡水魚(yú)類、40多種海水魚(yú)類的精液作了冷凍保存研究，并獲得了成功保存，并建立了精子冷凍庫(kù)(cryobank)。但目前還尚未取得一個(gè)統(tǒng)一的方法適用于各種魚(yú)類，因此，魚(yú)類精液冷凍保存技術(shù)還有待需要進(jìn)一步的探索和推進(jìn)。同時(shí)期，魚(yú)類胚胎冷凍保存也

2、開(kāi)始了相關(guān)研究。隨著生物技術(shù)和新型技術(shù)手段的不斷成熟和應(yīng)用，魚(yú)類胚胎冷凍保存研究的發(fā)展也取得了迅速的推進(jìn)。
　　星斑川鰈(Platichthys stellatus, Pallas1788)隸屬鰈形目(Pleuronectiformes)、鰈科(Pleuronectidae)、川鰈(Platichthys)屬。主要分布于白令海峽、楚科奇海、阿拉斯加和加拿大北部沿海以及北美和南加利福尼亞等，其中，在加拿大、美國(guó)、俄羅斯、中國(guó)、朝鮮、

3、韓國(guó)和日本等均有分布。但近些年，星斑川鰈的自然種群在我國(guó)已很少發(fā)現(xiàn)，并且星斑川鰈產(chǎn)精量少，限制了在人工繁育和雜交育種中的擴(kuò)大生產(chǎn)。
　　石斑魚(yú)為雌雄同體，暖水性海水魚(yú)類，以熱帶、亞熱帶分布居多，在我國(guó)主要分布于南海和東海。鞍帶石斑魚(yú)(Epinephelus lanceolatus)和七帶石斑魚(yú)(Epinephelus septemfasciatus)隸屬鱸形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑魚(yú)亞科(E

4、pinephelinae)、石斑魚(yú)屬(Epinephelus)。鞍帶石斑魚(yú)體型大、生長(zhǎng)迅速，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的新型品種，但其雄魚(yú)數(shù)量少，產(chǎn)精量有限，這些因素的限制造成現(xiàn)實(shí)不能夠滿足實(shí)際的需求。此外，生殖隔離也阻隔了石斑魚(yú)種間雜交的發(fā)展。七帶石斑魚(yú)是在我國(guó)黃海唯一有分布的、具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的種類。本實(shí)驗(yàn)室于2013年已對(duì)七帶石斑魚(yú)精子進(jìn)行了冷凍保存，并獲得了成功。目前，由于七帶石斑魚(yú)因神經(jīng)壞死病的復(fù)發(fā)蔓延，該魚(yú)產(chǎn)量受到了嚴(yán)重影響。
　　

5、為此，鑒于以上幾種魚(yú)類所存在的問(wèn)題，開(kāi)展魚(yú)類種質(zhì)保存研究是解決和保持水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)魚(yú)類遺傳多樣性的一種可行性方法，并且該研究的開(kāi)展已迫在眉睫，勢(shì)在必行。
　　本研究分別對(duì)星斑川鰈和鞍帶石斑魚(yú)兩種海水魚(yú)類的精子進(jìn)行了冷凍保存，在星斑川鰈精子冷凍保存研究中，主要對(duì)精子稀釋液(種類、成分、滲透壓)、激活海水適宜溫度，冷凍精液的適宜稀釋比例等方面進(jìn)行了篩選。研究得出，利用Ts-2和SFs-4作為稀釋液，10％DMSO為抗凍劑，

6、冷凍復(fù)蘇后用12℃海水激活能夠獲得較高的精子活力，并且利用稀釋20倍的凍精用于受精實(shí)驗(yàn)，能夠獲得較高的受精率。此外，運(yùn)用CASA系統(tǒng)對(duì)利用Ts-2和SFs-4冷凍保存的精子做了參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)利用SFs-4保存的精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)明顯高于Ts-2。
　　在鞍帶石斑魚(yú)精子冷凍保存研究中，主要對(duì)精子稀釋液種類、抗凍劑DMSO及 FBS適宜濃度作了篩選。結(jié)果得出，利用 ELS3和ELRS3作為稀釋液，15%DMSO和10%FBS作為抗凍劑，

7、精子的冷凍效果最好，解凍復(fù)蘇后精子活力最高。
　　同時(shí)，本研究對(duì)七帶石斑魚(yú)胚胎進(jìn)行了超低溫玻璃化冷凍保存，主要是從抗凍劑種類以及不同種類抗凍劑混合搭配使用對(duì)胚胎的毒性作用大小的角度，來(lái)篩選出毒性最低的最適宜的玻璃化液用于冷凍保存。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用35%PMG3+5%海藻糖(PMG3T)玻璃化液處理的未經(jīng)冷凍的胚胎的孵化率最高為31.76%，并經(jīng)冷凍保存后，發(fā)現(xiàn)78粒冷凍保存的卵中，解凍處理后有上浮卵6粒，并有1粒孵化出仔魚(yú)。

8、>　　此外，本研究還對(duì)利用PM、PMG3、PMG3T3玻璃化液處理和冷凍保存的七帶石斑魚(yú)肌節(jié)期胚胎內(nèi)的6種酶進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)鑒于玻璃化液處理和冷凍保存后的胚胎內(nèi)6種酶活性，除了MDA外，其他5種酶(SOD、CK、Na+/K+-ATPase、LDH、GSH-Px)活性均減少，表明冷凍和玻璃化液均使得胚胎細(xì)胞內(nèi)的抗氧化體系遭受損傷，造成胞內(nèi)能量代謝酶和某些抗氧化酶含量減少，脂質(zhì)過(guò)氧化損傷等，從而降低了冷凍胚胎復(fù)活率。通過(guò)對(duì)冷凍前后胚胎內(nèi)相關(guān)