多途徑組合對魚類精子超低溫冷凍損傷的挽救效應.pdf

1、目的：從膽固醇、靶向線粒體抗氧化劑MitoQ冷凍保存前導入和解凍復蘇后導入甲狀腺素這兩方面組合來研究，是否多種途徑共同作用對魚類冷凍凍精子質(zhì)量有更好的挽救效應。
　　方法：DCFH-DA/PI雙染色法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測精子細胞內(nèi)ROS水平；JC-1法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位（MMP）；ATP檢測試劑盒結(jié)合多功能酶標儀檢測ATP水平；TBA比色法結(jié)合多功能酶標儀檢測脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）；Western blot方法檢

2、測蛋白的表達。
　　結(jié)果：T3的添加方式是在精子解凍后直接加入到精子懸液中并在37℃環(huán)境中孵育，T3對黃顙魚凍精的作用濃度和孵育時間是7nM120 min時對黃顙魚解凍后精子的活力有明顯改善P＜0.05。對斑馬魚作用的濃度和時間是10 nM30 min時對斑馬魚解凍后精子的活力有改善作用。通過試劑盒檢測 T3對黃顙魚和斑馬魚凍精生化參數(shù)的影響：經(jīng)過 T3處理過的凍精ATP的含量都有明顯的升高（P＜0.05）,另外處理組MDA，RO

3、S含量下降，MMP水平上升的變化也都相一致。T3對魚類凍精的UCP2蛋白的表達并沒有明顯的變化（p≥0.05）。結(jié)果顯示 T3對黃顙魚和斑馬魚凍精的精子質(zhì)量有一定的改善作用。因此進一步研究多重藥物組合對魚類凍精精子質(zhì)量的影響。CLC和 MitoQ的添加方式是在精子冷凍前將這兩種物質(zhì)添加到精子懸液之后在室溫下孵育15 min后再進行冷凍。CLC和MitoQ對黃顙魚斑馬魚精子冷凍損傷具有明顯的改善作用已經(jīng)得到證實。因此將T3，CLC和Mit

4、oQ組合方式共CON，T3，CLC，MitoQ，CLC+ T3，MitoQ+ T3，CLC+ MitoQ和 CLC+MitoQ+T38個組別。T3，CLC，MitoQ單獨作用時對黃顙魚凍精的活力都有明顯的改善作用（p＜0.05），但是兩種或三種聯(lián)合作用與單獨作用并沒有明顯的差別（p≥0.05）。單獨作用對黃顙魚凍精 MDA的產(chǎn)生都有明顯的下調(diào)的作用，聯(lián)合作用時同樣沒有明顯的差別。另外，單獨作用及聯(lián)合作用對黃顙魚凍精 ATP，ROS的產(chǎn)生

5、和MMP都沒有明顯的作用。在黃顙魚的實驗結(jié)果中顯示，T3實驗組 UCP2表達水平與其他實驗組相比較有明顯的升高，其他實驗組之間 UCP2的表達水平并沒有明顯的差別。在斑馬魚結(jié)果顯示所有實驗組間均沒有顯著性的差別（ p≥0.05）， T3+ CLC+MitoQ實驗組相較于其他組UCP2的表達量有所下降。在黃顙魚實驗結(jié)果中顯示 CLC+ MitoQ及與 T3的組合作用對 Na+/K--ATPase的表達量與其他組相比較有明顯的升高（p＜0.

6、05）。而在斑馬魚結(jié)果中T3及MitoQ+T3實驗組Na+/K--ATPase的表達量較其他組有所升高。黃顙魚是結(jié)果顯示CLC+MitoQ+T3實驗組ATP citrate lyase的表達水平與其他實驗組相比較有明顯的升高（ p＜0.05）， CLC+ MitoQ實驗組中Hexokinase的表達水平與MitoQ及MitoQ+T3實驗組相比較有明顯的升高。斑馬魚凍精實驗結(jié)果中所有處理組中ATP citrate lyase的表達水平均比

7、較穩(wěn)定， CLC實驗組中 Hexokinase的表達量較其他實驗組有所上調(diào)，其他實驗組間無明顯的差別（p≥0.05）。黃顙魚實驗結(jié)果中CLC+ T3，CLC+ MitoQ實驗組PARP的表達水平較其他組相比有所升高，在斑馬魚實驗中 PARP的表達水平均沒有明顯的差別（p≥0.05）。黃顙魚結(jié)果中 GLUT1的表達水平均沒有明顯的差異，在斑馬魚中CLC+ MitoQ及CLC+ MitoQ+ T3實驗組GLUT1表達水平較其他組相比較有所升

8、高，其他組見均沒有明顯差異（p≥0.05）。
　　結(jié)論：T3，CLC，MitoQ對黃顙魚和斑馬魚凍精的精子質(zhì)量有一定的改善作用。任何兩種藥物聯(lián)合作用后對精子質(zhì)量的改善作用與單獨作用時并沒有明顯差別。三種物質(zhì)聯(lián)合作用與其他實驗組相比較同樣沒有明顯差別。T3對魚類凍精 UCP2的表達與其他實驗組相比較有輕微的上調(diào)作用。T3，CLC，MitoQ組合作用對黃顙魚和斑馬魚凍精的部分代謝蛋白有一定的影響，但是這些蛋白的變化對魚類凍精精子質(zhì)量的