低溫顯微鏡下孔雀魚、斑馬魚精子超低溫冷凍研究初探.pdf

1、低溫顯微鏡已成為低溫生物學(xué)研究中一個(gè)非常重要的技術(shù),人們借助這一技術(shù)可以直觀的觀察到生物樣品在冷凍和復(fù)溫過(guò)程中的形態(tài)變化,以及溶液相變的過(guò)程,從而分析生物材料的相關(guān)特性和生物體的低溫?fù)p傷機(jī)理以及確定最佳的降溫、復(fù)溫程序,并以此為依據(jù)客觀的解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果、修正理論模型和制定合理的治療或保存程序。低溫冷凍臺(tái)和SYBR/PI雙染色結(jié)合使用可以直接檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各階段精子膜的完整性。本文的研究?jī)?nèi)容主要是通過(guò)低溫顯微鏡篩選孔雀魚精子超低溫冷凍條件和

2、檢測(cè)斑馬魚精子在各速率下冷凍到各溫度段的膜完整性這兩個(gè)方面。
　　 在對(duì)孔雀魚(Poecilia reticutata)精子的超低溫冷凍研究中,主要研究孔雀魚精子對(duì)溫度的敏感性和篩選冷凍速率、解凍速率、抗凍劑的種類和濃度,并分析冷凍過(guò)程中觀察到的精子彎曲溫度、停止運(yùn)動(dòng)溫度、結(jié)冰溫度和解凍溫度等參數(shù)與精子解凍后活力的關(guān)系。精子敏感性判斷是通過(guò)低溫顯微鏡觀察沒(méi)有加抗凍劑的HBSS-精子懸液從35℃到-8℃,再?gòu)?fù)溫到35℃整個(gè)過(guò)程來(lái)評(píng)

3、定精子鞭毛構(gòu)型、游動(dòng)行為和活力的變化。冷凍速率篩選選用5,25,45,65℃/min和1,25,100℃/min兩組實(shí)驗(yàn)。抗凍劑的篩選包括14％甘油,10％二甲基亞砜,6％甲醇,5％二甲基乙酰胺四種不同種類抗凍劑和7％,14％,28％和50％四種濃度的甘油。復(fù)溫速率篩選選用5,25,45和100℃/min。敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著溫度的降低,精子直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)減慢,精子鞭毛由彗星式對(duì)稱擺動(dòng)在9℃左右開(kāi)始發(fā)生中段彎曲,并約在-5.5℃停止擺動(dòng)

4、。在復(fù)溫過(guò)程中精子在-1.9℃左右恢復(fù)鞭毛擺動(dòng),在5～6℃間中段彎曲恢復(fù)變直,直到9℃左右時(shí)可做冷凍前彗星式對(duì)稱快速擺動(dòng)并隨著溫度的升高精子可做環(huán)狀弧形軌跡運(yùn)動(dòng),直到溫度升到25～35℃時(shí)精子恢復(fù)快速直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在14％甘油的條件下,將精子在25℃/min的速率下冷凍到-80℃,然后在100℃/min的解凍速率下得到的精子活力最高,在35℃處活力最好可達(dá)到50～60％,這與我們采用程序冷凍儀常規(guī)冷凍得到的結(jié)果完全一致,同時(shí)

5、也發(fā)現(xiàn)此條件下精子發(fā)生彎曲溫度和停止運(yùn)動(dòng)溫度也最低。進(jìn)一步觀察在14％Gly抗凍劑條件下20條不同個(gè)體的冷凍效果,發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生彎曲彎度、停止運(yùn)動(dòng)溫度與解凍后活力有極顯著意義的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.81),這為深化低溫生物學(xué)理論研究和精子冷凍模型的建立提供重要的理論依據(jù)。目前還沒(méi)有用低溫顯微鏡來(lái)研究魚類精液冷凍的報(bào)導(dǎo),本研究是第一次。
　　 斑馬魚精子超低溫冷凍的研究主要是運(yùn)用低溫顯微鏡檢測(cè)精子冷凍到各個(gè)溫度段的各種冷凍速率效果和

6、分析精子發(fā)生損傷的主要溫度段。在1、25、65、100和130℃/min的速率下分別將精子冷凍到-10℃,-20℃和-30℃,檢測(cè)-10℃、-20℃和冷凍到各個(gè)溫度段后解凍到35℃處的精子膜完整性。另一組實(shí)驗(yàn)是在5、25、65、100和130℃/min的速率檢測(cè)精子冷凍到-80℃后,分別檢測(cè)解凍到4℃或35℃處精子的膜完整性。精子膜的完整性通過(guò)SYBR/PI雙染色來(lái)檢測(cè),各組實(shí)驗(yàn)分別用8％DMSO和4％MEOH兩種抗凍劑。在25～130

7、℃/min速率之間冷凍到-10℃時(shí),精子膜發(fā)生損傷率(PI％)僅為10％左右,解凍到35℃時(shí)約為15％,但是慢速率1℃/min條件下膜損傷率明顯升高,在解凍后35℃處達(dá)到28％左右。冷凍到-20℃時(shí)同樣是1℃/min慢速率膜損傷率顯著高于其他各組速率,其他各組速率之間沒(méi)有顯著性差異,在35℃處的精子膜損傷率約為20％左右。當(dāng)溫度降到-30℃后解凍到35℃處的PI％結(jié)果顯示各速率下8％DMSO實(shí)驗(yàn)組PI％均顯著低于4％MEOH實(shí)驗(yàn)組。8％

8、DMSO在25～130℃/min速率之間沒(méi)有顯著性差異,顯著低于1℃/min,精子膜損傷率為28％左右。而4％MEOH實(shí)驗(yàn)組則是慢速率1℃/min精子膜損傷率最低,但PI％也高達(dá)72％,當(dāng)速率達(dá)到25℃/min以上時(shí),精子膜損傷率達(dá)到90％以上。當(dāng)精子冷凍到-80℃時(shí)無(wú)論在解凍后4℃還是35℃處檢測(cè),均是5℃/min速率精子膜損傷率最低,8％DMSO實(shí)驗(yàn)組PI％約為48％,4％MEOH實(shí)驗(yàn)組為70％,當(dāng)冷凍速率達(dá)到25℃/min以上時(shí)兩

9、組實(shí)驗(yàn)的精子膜損傷率均高達(dá)95％以上。說(shuō)明8％DMSO實(shí)驗(yàn)組條件下斑馬魚精子冷凍到-30℃時(shí)25℃/min快速率精子膜損傷最小,在24％左右,當(dāng)精子冷凍到-80℃時(shí)5℃/min慢速率下精子膜損傷率最小,在45％左右,速率高于25℃/min后精子膜幾乎全部發(fā)生損傷。采用25℃/min從4℃冷凍到-30℃,再以5℃/min從-30℃冷凍到-80℃,解凍后精子膜的損傷率為28％左右。通過(guò)常規(guī)冷凍法驗(yàn)證兩步速率發(fā)現(xiàn)精子解凍后活力最好可以達(dá)到53