運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）對(duì)超低溫冷凍保存前后褐牙鲆精子的質(zhì)量評(píng)判.pdf

1、褐牙鲆(Paralichthys olivacens)屬鰈形目，牙鲆科、牙鲆屬，俗稱比目魚、片口。常棲息泥沙、砂石或巖礁地質(zhì)、水深20～50m和潮流較為通暢的沿岸水域，具潛伏習(xí)性，白天常潛伏在泥沙中不大活動(dòng)，夜間出來覓食。其自然分布區(qū)主要是中國(guó)沿海、朝鮮半島、日本和俄羅斯的亞洲海區(qū)，且生長(zhǎng)快、個(gè)體大、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，是名貴的重要海水養(yǎng)殖品種之一。褐牙鲆為冷溫性底棲魚類，比較適宜溫度較低的水環(huán)境，我國(guó)關(guān)于褐牙鲆人工繁殖、養(yǎng)殖及生理方面的研究

2、主要集中在北方地區(qū)。近幾年來，為加快海水養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)調(diào)整，對(duì)舟山本地褐牙鲆生殖生理方面的研究逐漸增多，并已初步建立適于舟山褐牙鲆的育苗生產(chǎn)工藝。本試驗(yàn)即通過建立一種快速而高效的超低溫冷凍保存模式，一方面為舟山褐牙鲆大規(guī)模工廠化苗種繁育提供可靠的參考依據(jù)；另一方面也為其種質(zhì)資源保存提供理論基礎(chǔ)。 1. 褐牙鲆精子的生理學(xué)特性及超低溫冷凍保存 褐牙鲆精漿pH值為(7.90±0.26)，精子密度為(1.03×1010)/ml，精漿

3、滲透壓為(308.50±7.85)mOsm/kg，K+、Na+在精漿中的濃度分別為(27±3)mmol/A、(71±5)mmol/L，精子壽命(23±2)min。在鹽度為35，pH為8時(shí)，精子的活力最高，分別達(dá)到(93.33±5.67)％和(89±3.33)％。精子在室溫(25℃)條件下，可存活4d；在低溫(4℃)條件下可以存活7d。以S3液作為稀釋液，16％的DMSO作為抗凍劑，利用快速降溫法對(duì)精子進(jìn)行超低溫冷凍保存，38℃水浴快速解

4、凍，解凍后的精子獲得最高的活力為(84±3.67)％。 此外，通過應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)對(duì)超低溫冷凍前后褐牙鲆精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：鮮精與凍精的運(yùn)動(dòng)精子占總精子數(shù)的百分率(MOT)，平均曲線運(yùn)動(dòng)速度(VCL)，平均直線運(yùn)動(dòng)速度(VSL)，平均路徑運(yùn)動(dòng)速度(VAP)和精子運(yùn)動(dòng)路線的曲折程度(LIN)相比，都有顯著性差異(p<0.05)，而激活0.5min時(shí)，鮮精和凍精的MOT值差異不顯著(p>0.05

5、)。同時(shí)超低溫冷凍前后，直線運(yùn)動(dòng)、曲線運(yùn)動(dòng)、左右擺動(dòng)和不運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)目占總精子數(shù)的百分值分別為(24.49+3.87)％、(48.53+4.55)％、(24.72+2.86)％和(2.27±1.22)％，而且隨著激活時(shí)間的延長(zhǎng)，褐牙鲆精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)發(fā)生改變，直線運(yùn)動(dòng)和曲線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)目逐漸減少，而不運(yùn)動(dòng)和左右擺動(dòng)的精子數(shù)目逐漸增多。 2. 褐牙鲆精子超微結(jié)構(gòu) 對(duì)自然成熟的褐牙鲆精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，電鏡顯示，褐牙鲆精

6、子的頭部近似球形，直徑(1.49±0.17)μm，尾部鞭毛較長(zhǎng)，達(dá)(40.17+0.65)岬。褐牙鲆精子由頭部和尾部(鞭毛)構(gòu)成。頭部的頂端無頂體，頭部的細(xì)胞核為圓形，染色質(zhì)致密。精子細(xì)胞質(zhì)膜與核膜間有較大間隙，兩者之間分布有許多細(xì)胞質(zhì)和少量囊泡。植入窩位于細(xì)胞核后端的凹陷處，中心粒復(fù)合體位于植入窩內(nèi)?；w長(zhǎng)軸與精子的長(zhǎng)軸平行，近端中心粒與基體呈鈍角排列?；w的頭端由電子致密物質(zhì)構(gòu)成，基體的尾端與鞭毛軸絲起始端的的9組外周二聯(lián)微管相連。