赤點(diǎn)石斑魚MHC基因的克隆與多態(tài)性分析.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)是免疫系統(tǒng)中對(duì)蛋白抗原異物起反應(yīng)的一類重要的免疫因子，廣泛分布于各種脊椎動(dòng)物體內(nèi)。本研究以我國(guó)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和養(yǎng)殖前景的赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelusakaara)為實(shí)驗(yàn)材料，采用PCR、RT-PCR、SMART-RACE、SSCP等技術(shù)對(duì)MHC家族MHCⅠA、MHCⅡA和MHCⅡB3個(gè)基因進(jìn)行克隆與多態(tài)性分析。主要結(jié)果如下：

2、1．本研究首次成功克隆獲得赤點(diǎn)石斑魚的MHC classⅠα鏈，MHC classⅡα鏈及β鏈等3個(gè)重要的非特異性免疫因子的cDNA全序列，其中MHC classⅠα鏈全長(zhǎng)1720bp，含3’UTR、啟動(dòng)子、多肽結(jié)合區(qū)(α1和α2)、免疫球蛋白樣區(qū)(α3)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和5’UTR。MHC classⅡα鏈全長(zhǎng)1870bp，含3’UTR、啟動(dòng)子、多肽結(jié)合區(qū)(α1)、免疫球蛋白樣區(qū)(α2)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和5’UTR。MHC class

3、Ⅱβ鏈全長(zhǎng)1350bp，含3’UTR、啟動(dòng)子、多肽結(jié)合區(qū)(β1)、免疫球蛋白樣區(qū)(β2)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和5’UTR。 2.3個(gè)免疫蛋白因子均具有經(jīng)典MHC蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)，在多肽結(jié)合區(qū)均存在極其豐富的變異。其中Ⅰα鏈的α1(1-90位)和α2(91-203位)分別由1個(gè)α螺旋和4個(gè)反向平行的β折疊組成，形成1個(gè)深溝狀凹槽，α3(204-298位)主要由β折疊組成。Ⅱα鏈的α1(24～99位)由1個(gè)α螺旋和4個(gè)反向平行的β折疊

4、組成，α2(100～200位)由多個(gè)β折疊組成。Ⅱβ鏈的β1(20～103位)1個(gè)α螺旋與4個(gè)反向平行的β折疊構(gòu)成多肽結(jié)合區(qū)，β2(116～204位)由多個(gè)β折疊構(gòu)成兩個(gè)反向平行的三明治結(jié)構(gòu)。 3.3個(gè)非特異性免疫因子在腦、心、脾、肝、頭腎、腸、肌肉、血細(xì)胞、胸腺、性腺，鰓，胃等12個(gè)組織均能有效表達(dá)，在頭腎，脾，胸腺等免疫組織表達(dá)量不僅高，而且表達(dá)多態(tài)性也異常豐富。遞呈內(nèi)源性抗原的MHC classⅠ在與外界病原接觸較多的鰓，

5、肌肉，腸等組織表達(dá)較弱，而遞呈外源性抗原的MHCclassⅡ在鰓，肌肉，腸等組織則有較強(qiáng)表達(dá)，體現(xiàn)了其表達(dá)與功能的適應(yīng)性。 4．建立了利用SSCP技術(shù)分離多肽MHC基因片段的方法，極大提高了MHC多態(tài)性基因的檢測(cè)效率。本研究所獲得的SSCP特異性引物及其建立的檢測(cè)方法，將可為今后大量檢測(cè)赤點(diǎn)石斑魚多態(tài)性MHC序列，篩選可針對(duì)特定病原的特異序列提供有力的工具。 5．根據(jù)3個(gè)分子的IGC區(qū)氨基酸序列構(gòu)建了脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化樹