斜帶石斑魚胃蛋白酶原和幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達研究.pdf

1、斜帶石斑魚在東南亞和中國南部，是重要經(jīng)濟海水魚種之一。斜帶石斑魚具有巨大的經(jīng)濟價值，國內(nèi)外有不少學者對其進行研究報道，但對其消化生理，尤其是消化酶的分子生物學研究，目前還沒有報道。本論文以斜帶石斑魚胃蛋白酶原和幾丁質(zhì)酶為對象，主要研究結(jié)果如下： 1、應用CloneMiner重組技術(shù)構(gòu)建了胃組織cDNA文庫，庫容量為5.6×106 cfu/ml。隨機挑取512個克隆測序，獲得293個EST序列。其中69.97％ESTs在GenBa

2、nk蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中找到同源性較高的序列，這些ESTs編碼的蛋白按生物功能可分能量代謝、消化酶類、蛋白合成、細胞信號傳導、轉(zhuǎn)錄和未知功能蛋白等10種類型，包括了16條胃蛋白酶相關(guān)EST序列和68條幾丁質(zhì)酶相關(guān)EST序列。該文庫保留了胃組織分子生物學信息，為克隆胃組織中功能基因和研究斜帶石斑魚消化生理的分子機制奠定了基礎(chǔ)。 2、本研究克隆的胃蛋白酶原C、A1和A2全長cDNA序列分別為1485bp、1764bp和1314bp，開放閱

3、讀框分別編碼387個、376個和377個氨基酸；信號肽預測，均在Gly16-Ile17位為信號肽切割位點；酶原激活位點預測分別在Phe53-Tyr54、Tyr45-Pro46和Phe45-Pro46位點。胃蛋白酶原A1、A2和C基因序列均由8個長度不一的內(nèi)含子和9個外顯子構(gòu)成，長度分別為3.0kb、2.3kb和3.4kb。Northern blot分析表明胃蛋白酶原C、A1和A2基因分別有3個、2個和3個轉(zhuǎn)錄本。對斜帶石斑魚與魚類酸性蛋

4、白酶氨基酸序列的同源性比較和進化樹分析結(jié)果顯示，胃蛋白酶原C、A1和A2基因都屬于魚類天冬酸蛋白酶中的胃蛋白酶原家族。 對胃蛋白酶原在斜帶石斑魚成體各組織和不同發(fā)育時期的表達情況的分析結(jié)果顯示，胃蛋白酶原A1 mRNA僅在胃中表達，胃蛋白酶原A2則在胃和中腸都有表達，而胃蛋白酶原C mRNA除了在胃中，還在腸、幽門垂、食管、鰓和性腺中檢測到。本研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)魚類胃蛋白酶原C和A2 mRNA在胃以外的非酸性環(huán)境的組織中表達，提示

5、胃蛋白酶C和A2除了有分解底物中蛋白的功能外，很可能還有其它的生理功能。 胃蛋白酶原C和A2 mRNA自受精卵和出膜后1天，就可持續(xù)被檢測到表達，并在出膜后29天表達量顯著增高；胃蛋白酶原A1在出膜后29天才檢測到有mRNA表達。結(jié)果提示，胃蛋白酶原C、A1和A2按次序性表達的模式，可能與斜帶石斑魚不同發(fā)育時期需要種類和數(shù)量不同的酶來消化各種食物中的蛋白有關(guān)。 3、本研究克隆的幾丁質(zhì)酶1和2 cDNA序列全長分別為165

6、8bp和1764bp，開放閱讀框長度分別為1434bp和1485bp，編碼477個和494個氨基酸，前21個氨基酸組成了信號肽，第22位氨基酸之后是成熟肽。氨基酸序列分析顯示這兩種基因都有典型的18家族幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)區(qū)域特征，含有g(shù)lyco-18區(qū)域、2型幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域、酶催化活性位點和一個鉸鏈區(qū)域。幾丁質(zhì)酶2的鉸鏈區(qū)域具有脊椎動物酸性幾丁質(zhì)酶的特征性序列，即絲氨酸和甘氨酸(S—G)重復序列；而在幾丁質(zhì)酶1氨基酸序列中含有一段特征性的頡氨

7、酸、天冬酰胺和脯氨酸重復序列(NVNPPVNPNVNP)。對斜帶石斑魚與其它脊椎動物幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的同源性比較和進化樹分析結(jié)果顯示，斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1和2分別與日本比目魚酸性幾丁質(zhì)酶1和2的同源性最高，而且都處于同一分枝上，屬于酸性幾丁質(zhì)酶大類。 4、利用表達載體pET3c—sumo建立了幾丁質(zhì)酶1和2成熟肽的原核表達系統(tǒng)，分別在大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導表達，獲得了分子量約62.7kDa和63.8kDa的

8、含有sumo和His—tag標簽的融合蛋白幾丁質(zhì)酶1和2，絕大部分以包涵體形式表達。通過純化包涵體，利用SUMO酶酶切去除sumo和His—tag標簽，再經(jīng)Ni—NTA Resin親和純化分離出純度為94％的單體蛋白幾丁質(zhì)酶1或2；并作為抗原分別免疫新西蘭大白兔，抗血清經(jīng)過硫酸銨沉淀純化，獲得了沒有免疫交叉反應、高特異性的兔抗幾丁質(zhì)酶1和2多克隆抗體。 5、根據(jù)幾丁質(zhì)酶1和2核苷酸序列設(shè)計特異性引物，以及應用本研究制備的多克隆抗

9、體，利用RT—PCR和Western blot方法進行時空表達分析，結(jié)果顯示幾丁質(zhì)酶1和2在不同組織中和發(fā)育時期均只有一種表達形式。幾丁質(zhì)酶1和2 mRNA在胃、中腸、脾臟和腎臟、皮膚中檢測到。但在蛋白水平，幾丁質(zhì)酶1只在胃和脾臟中有表達，而幾丁質(zhì)酶2表達僅限于胃。隨著斜帶石斑魚仔、稚、幼魚的發(fā)育，幾丁質(zhì)酶1在剛出膜即可檢測到有mRNA和蛋白低水平、持續(xù)表達，出膜后35天，mRNA表達量有所增高，而蛋白表達量到了65天才明顯上升。幾丁質(zhì)

10、酶2在出膜后第5天才檢測到有mRNA轉(zhuǎn)錄表達，直至出膜后65天才檢測到有蛋白表達。 免疫組織化學實驗結(jié)果顯示，在胃體部中胃腺的峽部、頸部和底部都有幾丁質(zhì)酶1和2免疫陽性反應，其中幾丁質(zhì)酶1在底部的免疫陽性細胞分布密度比幾丁質(zhì)酶2較高；在脾臟檢測到幾丁質(zhì)酶1免疫陽性細胞，但未檢測到幾丁質(zhì)酶2免疫反應性。 以上結(jié)果提示，幾丁質(zhì)酶1和2的表達都是翻譯水平調(diào)控，但調(diào)控機理有所不同；兩者的生理功能有異同，除了參與食物消化外，幾丁質(zhì)

11、酶1很可能還參與自身防御、免疫活動等生理過程，在仔魚和稚魚發(fā)育階段也可能參與十分重要的生理活動。 6、構(gòu)建了畢赤酵母表達載體pPIC3.5k、pPICZαA和pPGAPZαA，構(gòu)建了幾丁質(zhì)酶1和2成熟肽的表達質(zhì)粒，并獲得了胞內(nèi)表達重組幾丁質(zhì)酶1和2、組成型分泌表達重組幾丁質(zhì)酶1以及誘導型分泌表達重組幾丁質(zhì)酶2的GS115重組菌株，結(jié)果顯示畢赤酵母胞內(nèi)表達的重組幾丁質(zhì)酶1和2水解可溶性幾丁質(zhì)酶的酶活力分別為59.1U和56.2U；