斜帶石斑魚促性腺激素釋放激素基因的克隆及其表達研究.pdf

1、促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）是下丘腦分泌產(chǎn)生的神經(jīng)激素，它和腦垂體促性腺激素分泌細(xì)胞的特異性受體結(jié)合后刺激促性腺激素（gonadotropin，GtH）的產(chǎn)生和釋放，對性腺發(fā)育成熟與生殖行為起十分重要的作用。本文利用同源克隆和RACE方法，首次克隆得到斜帶石斑魚三種GnRH基因全長cDNA序列；通過序列比對分析GnRH基因與部分硬骨魚類結(jié)構(gòu)異同；通過進化樹分析GnRH基因與

2、其他脊椎動物的進化關(guān)系。使用RT—PCR技術(shù)分析GnRH基因在斜帶石斑魚組織分布情況；使用免疫組織化學(xué)定位sbGnRH分泌細(xì)胞在斜帶石斑魚下丘的分布。通過埋植17α—甲基睪酮（17α—MT）誘導(dǎo)斜帶石斑魚性逆轉(zhuǎn)，采用實時熒光定量PCR的方法，對埋植前后sbGnRHmRNA和sGnRHmRNA在下丘和垂體的變化表達差異進行分析。 主要研究結(jié)果如下： 1.克隆的斜帶石斑魚cGnRHⅡcDNA全長603bp，推導(dǎo)出cGnRHⅡ

3、cDNA前體由86個氨基酸組成，包括23個氨基酸組成的信號肽，10個氨基酸組成的十肽，50個氨基酸組成的聯(lián)合肽?？寺〉膕GnRHcDNA全長519bp，推導(dǎo)出sGnRHcDNA前體由91個氨基酸組成，包括23個氨基酸組成的信號肽，10個氨基酸組成的十肽，55個氨基酸組成的聯(lián)合肽。克隆sbGnRHcDNA全長432bp，推導(dǎo)出sbGnRHcDNA前體由95個氨基酸組成，包括22個氨基酸組成信號肽，10個氨基酸組成的十肽，60個氨基酸組成的

4、聯(lián)合肽。氨基酸序列比對表明，cGnRHⅡ保守性最高，sGnRH次之，sbGnRH保守性最低。進行進化樹分析表明，斜帶石斑魚的三種GnRH與條斑星鰈、舌齒鱸、金頭鯛、烏魚、大西洋絨須石首魚、紅擬石首魚、軍曹魚關(guān)系較近，特別是與尼羅羅非魚親緣關(guān)系最近，與人類的親緣關(guān)系較遠。 2.組織分布表明，凡與生殖調(diào)控有關(guān)的區(qū)域如嗅球、端腦、中腦、后腦、延腦、垂體和下丘腦、性腺等都有的sbGnRHmRNA表達，表明sbGnRH的表達區(qū)域與生殖控制

5、區(qū)域是一致的。免疫組織化學(xué)技術(shù)在下丘檢測到sbGnRH分泌細(xì)胞。cGnRHⅡmRNA只在中腦有表達，在其他腦區(qū)都沒有表達。sGnRHmRNA在嗅球、端腦、中腦、延腦表達量較高；下丘腦、垂體、后腦、卵巢、鰓、胃、腎、腸中有微弱表達。結(jié)合序列分析和進化樹分析，推測sbGnRH在斜帶石斑魚生殖系統(tǒng)中具有重要作用，而cGnRHⅡ和sGnRH不直接參與GtH合成與分泌的調(diào)控而是起神經(jīng)遞質(zhì)作用，間接參與生殖活動的調(diào)節(jié)。 3.利用MT埋植技術(shù)

6、，4周內(nèi)成功誘導(dǎo)斜帶石斑魚完成性逆轉(zhuǎn)。實時熒光定量PCR表明，下丘腦中的sbGnRHmRNA的轉(zhuǎn)錄活性水平在性逆轉(zhuǎn)完全轉(zhuǎn)變成功能性雄性后達到最高峰。推測sbGnRH對于精子發(fā)生和維持雄性性行為起重要作用，但是對于卵巢的發(fā)育和退化并無重要作用。垂體中，sbGnRHmRNA在性逆轉(zhuǎn)間性時達到高峰，暗示可能性逆轉(zhuǎn)的啟動首先需要高水平的sbGnRH在垂體的表達，從而引起下游垂體GtH水平的升高。sGnRHmRNA在下丘腦和垂體中的表達量很低，且